中华蜜蜂信息素结合蛋白OBP10的基因克隆、原核表达和配基结合特性分析

【目的】气味结合蛋白在中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉系统中起到重要作用,本实验拟研究中华蜜蜂一个新的信息素结合蛋白OBP10及其与蜜蜂信息素以及蜜源开花植物挥发物的结合特性。【方法】本实验通过RT-PCR扩增获得OBP10基因全长(Gen Bank登录号:KP717060.1),以p ET-30a构建原核表达载体,并以Ni2+琼脂糖柱进行重组蛋白表达和分离纯化,在N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子下利用荧光光谱法体外研究重组Acer OBP10与多种候选化学配基的结合特征。【结果】经多序列联配分析,发现Acer OBP10的多个同源基因均为信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)。配基结合特性分析显示,Acer OBP10对14种候选配基中的蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)竞争力最大,相对荧光可降至6.06%,解离常数11.04μmol/L;进一步表明Acer OBP10属于一个新的中蜂PBPs。此外,Acer OBP10也能和包括工蜂信息素(香叶醇和橙花醇)、报警信息素(2-庚酮和乙酸异戊酯)等蜜蜂信息素以及蜜源开花植物挥发物之一的β-紫罗兰酮结合,表明Acer OBP10可能是一种以信息素结合为主的多功能结合蛋白。【结论】Acer OBP10是中蜂一个新的信息素结合蛋白,与此前我们鉴定的蜂王信息素结合蛋白Acer ASP1相比,Acer OBP10对蜜蜂信息素的结合谱更为广泛,这些结果将对进一步研究中华蜜蜂信息素识别和传递提供理论基础,对于深入了解中华蜜蜂嗅觉影响生理功能的行为机制具有重要意义。     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因Acer-CSP1克隆与表达特征分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫化学感受系统中重要的组成部分之一。本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白基因Acer-CSP1, 其核苷酸全长351 bp （GenBank登录号为FJ157352）, 编码116个氨基酸残基, 预测蛋白分子量为13.85 kD, 等电点为4.89, 且含有4个保守的半胱氨酸残基, 均符合昆虫CSPs的一般特征, 且与意蜂CSP1基因具有99.1%的相似性, 与其他昆虫也有45.3%~68.0%的相似性。利用2^-ΔΔCt法及绝对定量法的real-time PCR技术对Acer-CSP1在中蜂不同器官表达特征进行了研究, 得出的一致结论为Acer-CSP1显著水平地高丰度表达于中华蜜蜂触角, 其次大量表达于头部。由于触角为中华蜜蜂最主要的嗅觉器官, 而头部则具有发达的感觉神经系统和味觉系统, 这也提示Acer-CSP1极有可能参与中华蜜蜂的嗅觉以及其他化学感受功能。     

中华蜜蜂信息素结合蛋白ASP1 cDNA的克隆及时空表达

信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在昆虫信息素的识别、传递和处理过程中具有重要作用。本研究首次克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana的一个PBP基因Ac-ASP1（GenBank序列号为DQ449670）,其预测蛋白具有典型的气味结合蛋白（OBPs）标志（即成熟肽含有6个保守的半胱氨酸）。利用real-time PCR技术对Ac-ASP1在中蜂不同组织和发育历期的时空表达谱进行了鉴定。绝对定量结果显示Ac-ASP1高丰度地表达于工蜂触角（2.07×10⁶ 拷贝数/μg）,而在其他组织（如头、胸、腹、翅及足）中呈低丰度表达（10²拷贝数/μg）; 相对定量结果显示Ac-ASP1在各发育历期如幼虫、蛹以及成虫发育早期（1～6日龄）均有大量表达,而在21日龄前后具有另外一个高丰度表达时期。这些结果可为明确Ac-ASP1在中蜂蜂王信息素信号识别传递过程中的作用提供参考。     

中华蜜蜂化学感受蛋白AcerCSP3的配基结合功能分析

为研究中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白AcerCSP3在化学感受系统中的生理功能, 本实验通过对AcerCSP3进行原核表达、分离纯化后, 利用荧光法研究了体外重组AcerCSP3与1-NPN以及候选化学配基的结合特征。Scatchard方程显示AcerCSP3与1-NPN的解离常数K_D为8.29 μmol/L, 结合位点数约等于1。在候选配基竞争1-NPN与AcerCSP3结合的实验中, 5种配基均能在200 μmol/L浓度下使1-NPN的相对荧光强度下降至50%以下, 其中β-紫罗兰酮甚至能使1-NPN的相对荧光强度下降至10%左右, 表明候选配基均与AcerCSP3有较强的结合能力, 而3, 4-二甲基苯甲醛与中蜂AcerCSP3的结合能力最强, K_D达到18.77 μmol/L。本研究所用化学配基均为植物花与叶片的挥发性的次生代谢产物, 表明AcerCSP3可能作为中蜂化学感受系统的一部分, 在其搜寻某些植物花粉蜜源时作为气味分子运载体发挥一定的作用。     

中华蜜蜂性信息素结合蛋白ASP1的原核表达及配基结合特性分析

【目的】研究中华蜜蜂Apis cerana cerana信息素结合蛋白ASP1与蜜蜂信息素及某些植物挥发物分子的结合功能。【方法】构建中蜂ASP1的原核表达载体, 对其进行重组蛋白的诱导表达和分离纯化, 并得到具有生化活性的中蜂ASP1重组蛋白, 最后以1-NPN作为荧光报告探针, 通过荧光竞争结合实验研究中蜂重组ASP1蛋白与蜜蜂信息素及其他气味分子的结合功能。【结果】在22种潜在信息气味物质中, 有7种与中蜂ASP1有较强的结合能力, 能将1-NPN的相对荧光强度降至50%以下。其中发现蜂王信息素两种成分对 羟基苯甲酸甲酯和香草醇的竞争能力最强, 可分别引起1-NPN相对荧光值下降99.31%和95.50%, 解离常数K_D分别为13.39和98.44 μmol/L; 而与除蜂王信息素外的其他信息素如幼虫信息素和工蜂信息素等分子均不结合。此外中蜂ASP1对于水杨酸甲酯、 苯乙醛、 3, 4-二甲基苯甲醛4-烯丙基藜芦醚和β-紫罗兰酮等5种植物挥发物质能产生强度不一的结合。【结论】中蜂信息素结合蛋白ASP1对蜂王信息素具有非常强的特异性, 同时也能结合某些植物挥发性气味分子, 暗示中蜂ASP1是一种以蜂王信息素识别为主要功能、 植物挥发物识别为次要功能的多功能信息素结合蛋白。     

新疆千叶蓍中化学成分及其抗氧化和抗菌活性研究

为探究生长于新疆的千叶蓍(Achillea millefolium L.)中的活性物质基础,本文对采自新疆哈密地区的千叶蓍开展了化学成分分离鉴定及其生物活性研究。利用柱层析色谱、制备型高效液相色谱等方法,从千叶蓍的全草中分离出二十种化合物。通过核磁共振和质谱等波谱学技术以及和文献数据对比,将其分别鉴定为猫眼草黄素(1)、矢车菊黄素(2)、槲皮素(3)、芹菜素(4)、芹黄素-7-O-β-D-葡萄糖苷(5)、(-)-芝麻素(6)、乙氧基阿魏酸(7)、咖啡酸乙酯(8)、香豆酸(9)、对羟基苯丙酸(10)、伞形花内酯(11)、7-甲氧基香豆素(12)、香草酸(13)、4-羟基苯甲酸(14)、二氢猕猴桃内酯(15)、paeoveitol B(16)、2-羟基-2-[(E)-1α,2β,3-三羟基-3-壬烷-5,7-二炔]-4H-吡喃(17)、吲哚-3-乙醛(18)、β-谷甾醇(19)和3β-羟基-5α,8α-环二氧麦角甾-6,22-二烯麦角甾醇过氧化物(20)。其中,化合物20为首次从本植物中分离得到,化合物6、8～10、12～13、15～18为首次从本属植物中分离得到。此外,初步评估了乙醇提取物、乙酸乙酯部位和化合物1～5、8～9、13～14和16的抗氧化及其抗菌活性。化合物3(IC50=9. 9±0. 94μM)和8(IC50=21. 29±1. 65μM)表现出显著的DPPH自由基清除能力,化合物9、14和16表现出抑制白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的能力。本文首次报道了分布于新疆的千叶蓍中化学成分及其活性,结果表明,酚类化合物如黄酮、苯丙素是该植物中的主要成分。此外,本研究发现千叶蓍中成分表现出一定的抗氧化和抗菌活性,为该植物作的药用价值提供了一定的科学依据。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

桔小实蝇气味结合蛋白BdorOBP2的cDNA克隆、组织表达及配基结合特性

为了研究桔小实蝇Bactrocera dorsalis气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)参与其嗅觉识别过程中的功能及其与植物气味的结合特性, 本研究克隆了桔小实蝇的一个气味结合蛋白基因, 命名为BdorOBP2（GenBank登录号为KC773766）, 并对该基因进行了原核表达。BdorOBP2开放阅读框长447 bp, 编码148 个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。定量PCR结果显示, 桔小实蝇BdorOBP2在不同组织中均有表达, 其中头部中的表达量最高, 翅中表达量最低（为头部表达量的63%±6%）。构建了BdorOBP2原核表达载体, 诱导并获得了重组BdorOBP2并进行了亲和层析纯化。最后以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN）为荧光探针, 利用荧光竞争结合实验测定了重组BdorOBP2与7种主要寄主水果气味物质的结合能力, 发现其对多数酯类和醛类化合物亲合力较强, 亲合力最强的气味物质为反-2-己烯醛和β-紫罗兰酮, 结合常数KD分别为9.96和15.37 μmol/L。本研究结果可为高效地开发和设计桔小实蝇的嗅觉引诱剂配方提供一定的理论依据和参考。     

茶树花香气及茶叶气味对中华蜜蜂的引诱效应

我国茶园面积约占全球的60%,茶树花已成为我国主要植物蜜源之一,尤其在秋冬季。茶树花招引蜜蜂的机理尚不清晰,遂以中华蜜蜂Apis cerana cerana为试虫,以8个国家级良种茶树的鲜花、茶树花主要香气组分和茶鲜叶重要挥发性组分为味源,用Y形嗅觉仪进行行为测定,结果表明:①在0.25—5.00 g质量范围内,不仅8个良种茶树的鲜花明显引诱该蜂,而且每种茶树花质量为某一确定值时,其引诱的蜂数与CK(洁净空气)引诱的蜂数差异显著(P0.05);②在茶树花27个主要香气组分中,发现苯乙酮(10~(-6) g/mL)、芳樟醇(10~(-6)、10~(-2) g/mL)、莰烯(10~(-4) g/mL)、顺-3-己烯-1-醇(10~(-10) g/mL)、α-法尼烯(10~(-6)、10~(-4)、10~(-2) g/mL)、癸醛(10~(-6) g/mL)、β-紫罗兰酮(10~(-6) g/mL)、亚油酸(10~(-4)、10~(-2) g/mL)、顺-2-戊烯-1-醇(10~(-4) g/mL)和苯甲醛(10~(-2) g/mL)显著引诱该蜂(P0.05),而水杨酸甲酯(10~(-2) g/mL)、橙花醇(10~(-2) g/mL)和辛醛(10~(-6) g/mL)排斥该蜂(P0.05);③在茶鲜叶24个重要挥发性组分中,发现十八醇(10~(-4) g/mL)、正辛醇(10~(-2) g/mL)、吲哚(10~(-6) g/mL)、柠檬醛(10~(-2) g/mL)、薄荷醇(10~(-6) g/mL)、β-石竹烯(10~(-4) g/mL)、薄荷酮(10~(-4)、 10~(-2) g/mL)显著引诱该蜂(P0.05),而邻甲苯酚(10~(-2) g/mL)、香茅醇(10~(-6) g/mL)、1,3-丙二醇(10~(-2) g/mL)、α-松油烯(10~(-6) g/mL)和正戊醇(10~(-4) g/mL)排斥该蜂(P0.05)。认为:茶树花气味及其主要香气组分和茶鲜叶主要挥发性组分显著引诱中华蜜蜂,尤其是茶树花香气组分中含量分别超过20%的苯乙酮和芳樟醇强烈引诱该蜂,导致花季时期广袤的茶园及其中的茶树花对该蜂具有强大的引诱效应。     

昆虫嗅觉结合蛋白研究进展

嗅觉结合蛋白是嗅觉系统的第一个参与者,主要表达在嗅觉外周系统淋巴液中,负责识别、结合和转运气味和信息素分子到达嗅觉受体。近些年,随着各种生物新技术的应用,大量昆虫嗅觉结合蛋白被鉴定出来,其各种不同功能得到揭示。本文对近年来嗅觉结合蛋白的分子特征、蛋白结构、功能和应用等方面的研究进展进行总结和综述。总的来说,嗅觉结合蛋白包括气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和尼曼 匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 proteins, NPC2)三大家族,在α-螺旋和β-折叠的基础上形成了相对简单而稳定的球形结构,使它们能适应各种环境和任务,所以嗅觉结合蛋白蛋白具有复杂多样的功能,且这些功能对昆虫生理和行为尤为重要。基于嗅觉结合蛋白功能,研究者已经把它们应用于生物防治、品种选育和制作生物嗅觉传感器等,具有巨大的潜在价值。本综述为昆虫嗅觉结合蛋白后续研究提供了参考信息及一些新的思路。