人SDCT2蛋白亚细胞定位信号分析

为了确定人高亲和力钠离子依赖性二羧酸共转运蛋白（high-affinity sodium-dependent dicarboxylate co-transporter, SDCT2,NaDC3）在细胞内的定位,构建了SDCT2与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白表达载体,并转染肾小管上皮细胞LLC-PK1,激光共聚焦显微镜观察显示,SDCT2蛋白主要定位于细胞的基底侧膜上.同时将SDCT2-EGFP融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达,可见融合蛋白的绿色荧光仅分布在细胞膜上.为了进一步确定该蛋白质的亚细胞定位信号序列,将SDCT2基因的N端及C端分别缺失,并构建缺失突变体与EGFP的融合蛋白表达载体,将它们转染到LLC-PK1中,观察SDCT2 缺失体在细胞内的分布情况.结果显示,N端缺失的SDCT2蛋白主要位于细胞质中,顶膜和基底侧膜上也有表达;C端缺失的SDCT2蛋白主要位于基底侧膜上,顶膜几乎没有表达,细胞质中表达很少.免疫组化结果也显示,SDCT2只表达于人近端肾小管上皮细胞的基底侧膜.这表明SDCT2蛋白的N端序列对其亚细胞定位是必需的,人SDCT2蛋白的基底膜定位信号位于N端序列中.     

新基因 P15RS 表达产物在人胃癌细胞细胞周期中定位的研究

P15RS是在p15INK4b高表达的人黑色素瘤细胞MLIK6 G1期中发现和克隆的新基因.研究表明,该基因可能在G1期作为增殖负调因子起作用.为了观察P15RS基因产物在细胞中的定位,构建了表达P15RS-EGFP融合蛋白的真核表达质粒pEGFP-P15RS.用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因,以人胃癌细胞BGC-823为实验模型,将pEGFP-P15RS转染BGC-823细胞.实验表明,P15RS基因表达产物在G1期、S期和G2期均定位于细胞核内,未见在核仁中分布,M期凝缩的染色体上未见.因此,P15RS可能定位在核质中.     

EGFP/SDCT1融合蛋白表达、亚细胞定位信号分析、组织分布及电生理功能研究

从正常人肾中克隆低亲和力钠离子依赖二羧酸共转运蛋白 1(sodium-dependent dicarboxylate co-transporter 1, SDCT1, NADC1)全长基因, 并将其和N端及C端缺失突变的SDCT1基因分别插入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达载体中构建EGFP/SDCT1融合蛋白真核表达载体, 然后将它们转染到人肾小管上皮细胞HKC中表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位情况以确定其定位信号. 双重PCR分析证实融合基因已整合到细胞基因组中, Western blot显示融合基因已在细胞中得到表达. 共聚焦显微镜分析显示正常人SDCT1蛋白主要定位于细胞膜上, 与生物信息学的预测结果一致, 而C端缺失的SDCT1基因转染的细胞, 其绿色荧光位于细胞质, N端缺失基因转染的细胞, 其绿色荧光主要位于细胞膜上. 将体外转录的融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达并用双电极电压钳技术记录细胞跨膜电流, 结果在卵细胞膜上测定出了Na⁺内向电流. 免疫组化结果显示SDCT1主要表达于人近端肾小管上皮细胞的管腔侧, 而在远端肾小管、集合管、肾间质和肾小球中未见SDCT1的表达. 上述研究表明, 正常人SDCT1蛋白定位于近端肾小管上皮细胞的管腔侧膜上, SDCT1蛋白的C端部分对于其合成后的迁移及靶向定位是必需的, 人SDCT1蛋白的细胞膜定位序列可能位于其C端部分.     

小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21蛋白表达及定位的影响

初步探讨在小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21 蛋白表达及定位的影响。通过显微操作技术注射野生型、持续激活型及激酶失活型的PKB的mRNA,用免疫荧光方法检测p21蛋白的细胞定位、Western blot 方法检测p21蛋白的表达。结果显示在注射不同形式的PKB mRNA 后p21蛋白的表达无明显差别,但是细胞定位发生改变,PKB被激活后,p21蛋白滞留在胞浆中。因而初步认为在小鼠受精卵中,PKB/Akt通过影响p21 的细胞定位而影响细胞周期的进程。     

小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21蛋白表达及定位的影响

初步探讨在小鼠受精卵早期发育过程中PKB/Akt对p21蛋白表达及定位的影响。通过显微操作技术注射野生型、持续激活型及激酶失活型的PKB的mRNA,用免疫荧光方法检测p21蛋白的细胞定位、Western blot方法检测p21蛋白的表达。结果显示在注射不同形式的PKB mRNA后p21蛋白的表达无明显差别,但是细胞定位发生改变,PKB被激活后,p21蛋白滞留在胞浆中。因而初步认为在小鼠受精卵中,PKB/Akt通过影响p21的细胞定位而影响细胞周期的进程。     

HeLa细胞表达分泌重组eGFP-DPF-1在卵母细胞上的定位

将兔输卵管蛋白(DPF-1)基因连结于增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因5′端,构建了真核表达重组质粒(pEGFP-N1/DPF-1),转染HeLa细胞,获得稳定表达分泌融合蛋白eGFP-DPF-1的HeLa细胞株。该融合蛋白呈现的分子量达120 KD,提示经翻译后修饰。取兔卵母细胞-卵丘细胞复合物(COC)、去除卵丘细胞后的卵母细胞或输卵管内的卵母细胞,与该株细胞共培养或培养于该株细胞条件培液中,观察兔输卵管蛋白在兔卵母细胞上的分布。结果显示DPF-1大量结合于卵母细胞透明带,先结合于透明带内层,然后维持在内层多外层少的分布状态上;在卵母细胞质膜表面则呈点状均匀分布。DPF-1在卵母细胞上的分布不受其周围颗粒细胞的阻碍,且颗粒细胞上未见有DPF-1结合的痕迹。本实验首次证实体外真核细胞表达分泌的输卵管蛋白能与卵母细胞结合,并借助绿色荧光蛋白作为示踪信号体外直接观察到该表达产物在卵母细胞上的动态分布,为进一步深入分析输卵管蛋白的功能提供了线索,也为研究输卵管内其他蛋白在配子/早胚上定位提供了可行的办法。     

核定位信号分析示踪载体——pGST-EGFP的构建及功能鉴定

目的 构建谷胱甘肽转硫酶（GST）与EGFP相融合的新型蛋白质示踪载体--pGST-EGFP,以用于蛋白质细胞亚定位信号序列的深入分析.方法 以质粒pEGFP-N1为骨架,融合从pGEX-2TK载体中扩增的GST编码序列,构建成pGST-EGFP融合表达质粒;再插入人工合成的已知核定位蛋白SV40的核定位序列（NLS）,构建成pGST-EGFP-SV40 NLS作为阳性对照;另外,构建小分子量蛋白TNNI2在pGST-EGFP的融合表达质粒.将对照pEGFP-N1和各重组质粒分别用脂质体介导,瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察蛋白的核定位情况.结果 单独表达的EGFP呈全细胞分布,而GST-EGFP融合蛋白只存在于细胞浆;SV40 NLS能将GST-EGFP融合蛋白带进细胞核.虽然TNNI2-EGFP融合蛋白的细胞亚定位呈现核内丰度更高的特点,但TNNI2-GST-EGFP融合蛋白仅限定于胞浆分布,提示TNNI2不能主动定位到细胞核中.结论 成功构建了蛋白质细胞亚定位示踪载体--pGST-EGFP.作为核定位信号分析系统,其对小分子蛋白细胞亚定位的示踪效果优于传统的pEGFP载体,更适用于科研工作中小分子量蛋白质核定位信号序列的研究.     

HeLa细胞表达分泌重组eGFP—DPF-1在卵母细胞上的定位

将兔输卵管蛋白(DPF-1)基因连结于增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因5′端,构建了真核表达重组质粒(pEGFP-N1／DPF-1),转染HeLa细胞,获得稳定表达分泌融合蛋白eGFP—DPF-1的HeLa细胞株。该融合蛋白呈现的分子量达120KD,提示经翻译后修饰。取兔卵母细胞-卵丘细胞复合物(COC)、去除卵丘细胞后的卵母细胞或输卵管内的卵母细胞,与该株细胞共培养或培养于该株细胞条件培液中,观察兔输卵管蛋白在兔卵母细胞上的分布。结果显示DPF-1大量结合于卵母细胞透明带,先结合于透明带内层,然后维持在内层多外层少的分布状态上;在卵母细胞质膜表面则呈点状均匀分布。DPF-1在卵母细胞上的分布不受其周围颗粒细胞的阻碍,且颗粒细胞上未见有DPF-1结合的痕迹。本实验首次证实体外真核细胞表达分泌的输卵管蛋白能与卵母细胞结合,并借助绿色荧光蛋白作为示踪信号体外直接观察到该表达产物在卵母细胞上的动态分布,为进一步深入分析输卵管蛋白的功能提供了线索,也为研究输卵管内其他蛋白在配子／早胚上定位提供了可行的办法。     

ZNF230/荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在Cos细胞中的表达与定位

为了用绿色荧光蛋白标记观察人类无精症相关基因ZNF230在Cos7细胞中的蛋白质表达及定位,用PCR方法扩增得到突变的人和小鼠mt ZNF230和mt znf230基因,使其3′端的终止密码TGA突变为TGG,并装入T 载体,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP N1的绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)基因融合,构建了ZNF230—荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入Cos7细胞系。荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP N1转染的Cos细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP ZNF230和pEGFP znf230的Cos细胞中荧光主要聚集在细胞核中。表明转染的Cos细胞系能高效表达人ZNF230和小鼠znf230蛋白,ZNF230基因表达的蛋白定位于细胞核内。     

小鼠Myf5真核表达载体的构建及其在细胞中的定位

目的：获得小鼠生肌调节因子Myf5基因并构建pEYFP-C1真核表达载体,观察Myf5在小鼠C3H10T1/2细胞中的定位。方法：利用PCR获得Myf5基因克隆到pEYFP-C1载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染C3H10T1/2细胞,荧光观察融合蛋白的表达。结果：从小鼠cDNA文库中得到760bp的myf5的CDS序列后,重组到pEYFP-C1载体中并转染C3H10T1/2细胞,荧光显示Myf5蛋白定位在细胞核中。结论：Myf5载体成功构建并在小鼠C3H10T1/2细胞表达,证明了Myf5蛋白定位于细胞核,为进一步研究Myf5与其他蛋白的相互作用奠定了基础。     

PS1/GFP融合蛋白对PS1的亚细胞定位的初步研究

PS1基因突变与早发家族性老年痴呆有密切联系.构建pEGFP-C1-PS1以及pEGFP-N2-PS1融合基因表达载体,于HEK293和CHO细胞系中表达PS1/GFP融合蛋白,以GFP绿色荧光作为PS1的亚细胞定位信号,通过SPOTII以及CONFOCAL显微镜进行观察,初步获得PS1全长蛋白在细胞中定位的部分信息,即PS1定位于细胞核膜,细胞质内有不均匀的分布,少量存在于细胞-细胞接触处的细胞膜上.     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C1-PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位.方法:采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达栽体,脂质体Lip2000介导转染MDA-MB-231细胞,real-time PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位.结果:酶切和测序结果证实重组质粒含有PPARγ编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布.结论:成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA-MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核.     

杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的细胞定位

为研究核基质结合区结合蛋白的功能及调控机制,PCR扩增杜氏盐藻MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列,与绿色荧光蛋白基因融合构建真核表达载体,脂质体转染CHO细胞,Western blotting和荧光显微镜检测基因表达情况和细胞定位。结果显示:MBP及N端和C端融合蛋白成功在CHO细胞表达,MBP和C端部分定位于细胞核且聚集于核仁,N端部分分布整个细胞,说明MBP定位于细胞核且细胞定位信号位于C端,MBP可能与rRNA前体结合发挥作用。     

CYP21和CYP21P基因启动子序列对绿色荧光蛋白基因表达的影响

特异性扩增CYP21基因和CYP21P基因启动子区域－770bp--1bp片段,去除pEGFP-N1载体中的CMV启动子,构建含CYP21基因启动子的pEGFP-N1载体（pCYP21)和CYP21P基因启动子的pEGFP-N1载体（pCYP21P),分别将上述两种构建载体、野生型pEGFP-N1(阳性对照）质粒及阴性对照转染入肾上腺皮质来源的Y1细胞系中,用倒置荧光显微镜,以及激光共聚焦显微镜等方法观测绿色荧光蛋白的表达。转染后,在荧光倒置显微镜下首次发现Y1细胞中出现绿色荧光蛋白的时间阳性对照为3小时,pCYP21为7小时,pCYP21P与阳性对照（未转染任何载体的Y1细胞）始终未观测到绿色荧光蛋白。阳性对照和pCYP21的绿色荧光蛋白表达强于pCYP21,pCYP21P与阴性对照始终未观测到绿色荧光蛋白。阳性对照和pCYP21的绿色荧光蛋白在胞核中的荧光强度高于胞浆。上述结果进一步表明,含有CYP21和CYP21P两种基因启动子的GFP质粒在Y1细胞中表达存在显著差异。     

EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运

为了解EV71病毒对细胞核转运机制的影响,本研究构建了具有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体(pG-FP-NLS)。将此表达载体转染细胞后,使用EV71病毒感染转染细胞,结果发现EV71病毒可以有效阻止绿色荧光蛋白的核转移。将EV71病毒的2A蛋白酶真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞,可以发现2A蛋白酶可阻止具有核定位信号的绿色荧光蛋白的核转移而使绿色荧光蛋白表达于细胞浆。为了进一步研究病毒阻止核转移的机制,病毒感染细胞或通过转染2A蛋白酶真核表达载体进行Nup62的Western blotting检测,结果显示病毒以及2A蛋白酶均可引起Nup62表达下降。证明EV71可通过2A蛋白酶切割Nup62从而抑制核转运。     

copine V蛋白的亚细胞定位

目的：确定copine V蛋白的亚细胞定位,初步研究该蛋白的生物学功能.方法：将copine V编码区基因分别构建真核表达载体pEGFP-copine V（或pRED-copine V）,转染HEK293、HeLa细胞,在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1（或pRED-N1）的细胞比较观察.结果：经限制性内切酶分析鉴定,构建的重组表达载体正确.通过激光共聚焦荧光显微镜观察,转染了重组载体pEGFP-copine V的细胞荧光信号集中分布于胞膜和内膜系统;进一步研究表明copine V定位于内质网而非线粒体,而空载体则在整个细胞中均匀分布.结论：copine V蛋白定位于细胞膜和内质网上,而不定位于线粒体.     

人ob基因克隆及其亚细胞定位的研究

目的:旨在克隆人肥胖(obese,ob)基因的全长cDNA序列,与EGFP重组构建融合蛋白表达载体,并分析其亚细胞水平的定位.方法:提取人脂肪细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出人ob基因cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-CI,重组质粒转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜分析EGFP-ob融合蛋白的亚细胞定位.结果:克隆的ob基因cDNA为501bp,共编码167个氨基酸,与GenBank公布的人ob基因序列一致,荧光显微镜分析表明,重组的EGFP-ob融合蛋白主要分布于NIT-3T3的细胞质中.结论:成功克隆了人OB基因的cDNA序列,构建人OB基因的真核表达载体pEGFP-CI-ob,融合蛋白EGFP-ob定位于NIH-3T3细胞质中.     

拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA—MB-231细胞中的表达

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—C1—PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位。方法：采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达载体,脂质体Lip2000介导转染MDA—MB-231细胞,real—time PCR和western—blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果：酶切和测序结果证实重组质粒含有PPAIh编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布。结论：成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA—MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核。     

荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白在BHK-21细胞亚细胞定位的影响

【目的】探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1,EHV-1)gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。【方法】以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和p Ds Red2-N1质粒,构建p Ac-GFP-gD(GFP-gD)和p Ds-gD-Red(gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD’(S-GFP-gD’)重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至p VAX-1表达载体,构建p VAX-Flag-gD(Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。【结果】成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。【结论】不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。