弧菌外膜蛋白OmpU的免疫交叉反应性和交叉保护性北大核心CSCD

【目的】通过对弧菌外膜蛋白Omp U的克隆、表达以及免疫学特性分析,明确外膜蛋白Omp U是否为弧菌的共同抗原,并具有免疫交叉反应性和交叉保护性。【方法】对弧菌外膜蛋白omp U基因进行克隆和生物信息学分析。分别制备副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和霍乱弧菌的Omp U重组蛋白抗血清,对Omp U的免疫交叉反应特性以及抗原表位定位情况进行比较分析。以霍乱弧菌的Omp U重组蛋白免疫小鼠后,再以多种弧菌进行攻毒,分析其交叉免疫保护作用。【结果】外膜蛋白Omp U在弧菌种内和种间相似性分别为73.0%–100%和58.6%–89.0%,并至少存在9个保守的B细胞抗原表位。Omp U重组蛋白抗血清在弧菌种内和种间均产生显著的免疫交叉反应,识别弧菌中分子量35–40 k Da的同源蛋白。副溶血弧菌ATCC17802、创伤弧菌ATCC27562和拟态弧菌ATCC33653来源的Omp U重组蛋白抗体能识别供试菌株,提示这些菌株的Omp U抗原表位定位于细胞表面。Omp U重组蛋白对免疫后的小鼠具有交叉免疫保护作用,攻毒实验后小鼠相对存活率(RPS)为43.0%–100%。【结论】上述结果表明,外膜蛋白Omp U是弧菌中一种保守的共同抗原,具有免疫交叉保护性,可以作为弧菌广谱疫苗的候选抗原。     

鱼类病原菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展

细菌性疾病是水产养殖病害中最常见且危害甚为严重的一类疾病1。长期以来,一直用于鱼类细菌性疾病防治的西药类药物,由于会导致病原菌产生耐药性,在鱼体内产生药物残留危害人类健康等副作用而被限制使用2。因此,为了选择更加安全有效的防治方法,疫苗免疫逐步得到了人们的重视。       

弧菌标准菌株外膜蛋白的比较研究

对32种弧菌标准菌株的外膜蛋白(OMP)进行了比较研究。32株弧菌标准菌株外膜蛋白的SDS-PAGE图谱各不相同。不同菌株的外膜蛋白有很大差异,一般为3～7条,分子量范围为91000～14000。多数菌株有相同的主要外膜蛋白如54000,43000和27000为许多菌株所共有,但未发现所有菌株共同的外膜蛋白。     

水产动物副溶血弧菌病及其噬菌体防治研究进展

副溶血弧菌是水产动物弧菌病的重要病原微生物之一,又是食源性致病菌,摄入被其污染的水产品后可引发肠胃炎、败血症和坏死性筋膜炎等疾病,对水产养殖业及公共卫生安全均具有较大威胁。抗生素大量使用甚至滥用,不可避免地会带来水产品药物残留和细菌耐药等问题,开发安全有效的抗生素替代品迫在眉睫。作为细菌病毒,噬菌体具有宿主特异性强、易筛选、易保存、高效直接等优点,在水产养殖病害防控和食品安全领域受到广泛关注。本文概述了水产动物的副溶血弧菌病及该菌噬菌体防治的研究进展,为副溶血弧菌噬菌体及制剂应用于水产养殖病害生物防控提供参考。     

病原弧菌的致病机理

由弧菌属细菌 (Vibriospp.)引起的弧菌病 (Vibriosis)是在世界各地海水养殖鱼、虾、贝类等动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病。在已知的弧菌中,有 10多种是海洋养殖动物的病原菌。长期以来,人们对病原弧菌的致病性研究一直是利用分离菌株对养殖动物进行各种方式的人工感染,通过观察实验动物是否发病来判断病原弧菌的致病性,而对弧菌病的发生、发展等过程缺乏深入的了解。由于对病原弧菌致病机理的研究最终将会为弧菌病的防治提供可靠的科学依据,近十年来,对病原弧菌的致病机理研究已成为对弧菌病研究的重点和最活跃的研究领域,研究工作主要包括对常见的病原弧菌在养殖动物体内外环境中的生       

副溶血弧菌SH112株OmpA蛋白的高效表达及免疫学特性

【目的】我们前期研究表明副溶血弧菌SH112株的OmpA蛋白在该菌的致病过程中发挥重要作用,是亚单位疫苗研制的潜在靶标抗原。本研究进一步对ompA(VPA1186)基因进行克隆表达,并研究其免疫学特性。【方法】扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达载体,基因测序后对其编码蛋白质进行生物信息学分析。重组蛋白His-OmpA经纯化后,免疫ICR小鼠制备鼠多抗血清。Western blotting检测该蛋白的免疫原性及鼠多抗血清的特异性。动物实验验证其免疫保护率。【结果】成功表达分子量约为40.0 kDa的重组蛋白His-OmpA。制备的鼠多抗血清ELISA效价可达1∶50000以上。Westernblotting检测结果显示,该血清可与His-OmpA蛋白、总外膜蛋白和全菌蛋白发生特异性反应,说明所表达的目的蛋白保持原蛋白的免疫原性。此外,该高免血清可与其他主要血清型的副溶血弧菌发生特异性交叉反应,而与其他非副溶血弧菌菌株无交叉反应,表明该血清特异性较高,且提示OmpA蛋白可能是副溶血弧菌属的共同保护性抗原。小鼠免疫保护实验结果表明,该蛋白可提供约35%的免疫保护率。【结论】OmpA蛋白可作为诊断副溶血弧菌感染和亚单位疫苗研制的靶蛋白,为进一步开展该蛋白的功能研究提供了参考。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白与病原菌凝集作用靶标的鉴定

血蓝蛋白是一种具有多种非特异性免疫学活性的多功能蛋白,以前的研究发现,血蓝蛋白具有凝集活性.本研究采用凝集抑制实验和亲和蛋白质组学等方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白与病原菌的凝集作用靶标.结果显示,大肠杆菌K12和副溶血弧菌外膜蛋白可以抑制血蓝蛋白对7种细菌的凝集活性,其中大肠杆菌K12中2种分子质量分别为16 kD、18 kD （命名为 p16、p18）的外膜蛋白可以与血蓝蛋白发生特异性的结合,经MALDI-TOF/MS鉴定,p16、p18 分别与大肠杆菌外膜蛋白OmpC、OmpX具有高度同源性.尤其是与大肠杆菌K12野生菌株相比,血蓝蛋白对 ΔOmpX 的凝集特异性明显降低,后者仅为前者的25％.由此推测,OmpX 应为血蓝蛋白与病原菌的凝集作用靶标.     

鮸鱼弧菌病病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

【目的】2009年春季,浙江省舟山地区养殖鮸鱼暴发弧菌病。症状主要表现为体表病灶部位出血、肌肉溃烂、内脏器官有白斑等。【方法】从病鱼体表溃疡部位及内脏分离出优势菌株090212,经人工感染证实该菌即为致病菌。通过API系统和菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定以及16S rRNA测序分析等综合鉴定,【结果】确认090212为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),该菌为革兰氏阴性,菌体呈短杆状,极生单鞭毛。该菌对氟苯尼考、四环素等5种抗生素敏感。【结论】哈维氏弧菌是海水养殖鱼类的常见致病菌,但作为养殖鮸鱼的病原菌尚属首次报道,将对鮸鱼的病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

草鱼抗菌肽Hepcidin过表达对拟态弧菌生长和NF-κB通路的影响

【背景】拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种严重危害水产养殖业的病原菌,可引起鱼类弧菌病,目前使用抗生素防治该病存在较多弊端。【目的】在细胞水平探讨过表达草鱼抗菌肽Hepcidin (CiHep)对拟态弧菌生长和NF-κB通路的影响。【方法】构建重组真核表达质粒pEGFP-N1-Cihep和pcDNA3.1(+)-Cihep。将pEGFP-N1-Cihep转染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellakidney,CIK),通过免疫荧光法和Western blotting检测转染后不同时间融合蛋白EGFP-CiHep的表达情况。进一步检测转染pcDNA3.1(+)-Cihep后的CIK细胞培养上清液对拟态弧菌生长的影响,以及转染细胞内NF-κB通路激活关键基因和下游免疫相关基因的转录水平。【结果】融合蛋白EGFP-CiHep在CIK细胞内能够良好表达,且以转染后48 h的表达量最高;转染后的细胞培养上清液能够显著抑制拟态弧菌生长;过表达CiHep可显著改变NF-κB通路激活关键基因和下游免疫相关基因的转录水平。【结论】 CiHep具有抑制拟态弧菌生长和激活NF-κB通路的作用。研究结果为鱼源Hepcidin的开发应用提供了理论依据,有望实现从激活NF-κB通路正向调控抗菌肽表达的新角度防治鱼类拟态弧菌病。     

大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选

弧菌是海水养殖环境中常见的条件性致病菌,弧菌病的暴发给水产养殖业造成了严重损失。鉴于水生动物尤其是鱼类弧菌病的发生常常是多种（血清型或亚种）弧菌的混合感染,筛选具有潜在的交叉保护性蛋白抗原,作为制备多价疫苗或联合疫苗的侯选成分具有重要意义。文中从患病大黄鱼中分离到8株弧菌,经生理生化和分子生物学鉴定分别为6株哈维氏弧菌Vibrio harveyi,1株溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和1株副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus。选择典型的不同种的弧菌为代表,提取其外膜蛋白,经SDS-PAGE和Westernblotting分析,确定它们大约在45 kDa、35 kDa、22 kDa处出现了3条共同的免疫印迹条带,表明它们很有可能含有共同的能够彼此交叉保护的抗原。利用双向电泳和免疫印迹相结合的方法,借助于MALDI-TOF-MS质谱分析技术,发现溶藻弧菌V.alginolyticus的一种功能未知的孔蛋白（Porin,GenBank Accession No.ZP₀1260407）和副溶血弧菌V.parahaemolyticus的一种麦芽糖孔蛋白的前体蛋白（Maltoporin precursor,GenBank AccessionNo.NP₈01154）能够和哈维氏弧菌V.harveyi全菌多抗产生免疫反应,表明这两种蛋白可以作为3种弧菌的交叉保护性抗原,以此制备的疫苗可望对3种弧菌的感染产生交叉保护作用。     

用伤寒杆菌温敏突变株诱导小鼠免疫保护作用

<正>伤寒仍然是发展中国家的一个严重问题。在这些国家的供水和污水排放设施达到世界其它地区的水平之前,免疫仍是减少该病发病的最有效方法。时下可以使用的灭活全菌体疫苗仍很不理想,常伴有严重的副作用。在伤寒菌苗研究方面,目前正在致力研究的项目包括伤寒杆菌gal E和aro A减毒株,新的纯化荚膜多糖(Vi抗原)和外膜蛋白的方法。     

中草药复方对拟态弧菌的体内外抗菌和拮抗外毒素的作用

目的探明拟态弧菌外毒素的致病性,筛选出对拟态弧菌具有良好抗菌和拮抗外毒素作用的中草药复方。方法培养拟态弧菌安徽分离株,采用蛋白分离技术提取其外毒素,测定其对实验草鱼的致病性。以黄连、大黄、金银花、夏枯草、丹皮、地锦草、连翘、茯苓、车前子、黄芪和甘草组成3个复方,采用改良微量稀释法测定不同中草药复方对拟态弧菌的体外抑菌作用。同时使用动物模型测定不同中草药复方拮抗外毒素作用和对拟态弧菌感染草鱼的保护作用。结果4株拟态弧菌产生的外毒素对实验鱼均具有较强的致死性。复方3的体外抑菌作用最强,对4株拟态弧菌的MIC值均为1.96g/L;其次为复方1,其MIC值介于3.92～7.84g/L;复方2的抑菌作用最差,其MIC值介于62.72～125g/L。复方3拮抗外毒素作用最强,其次为复方2,复方1不具有抗毒素作用。复方3对拟态弧菌感染草鱼具有最好的保护作用,保护率为100%;其次为复方2,保护率为23.81%;复方1的保护率最低,仅为19.05%。结论拟态弧菌外毒素在腹水病发生过程中起着重要致病作用。复方3具有良好的抗菌和拮抗外毒素作用,为筛选出的最佳复方,可进一步研制成为治疗腹水病的中草药复方制剂。     

环介导恒温扩增技术快速检测溶藻弧菌

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,其快速检测具有重要意义.根据溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,设计一套引物,通过条件优化.成功建立了针对致病性溶藻弧菌的环介导恒温扩增检测技术(loop-mediated isothennal amplification.LAMP).应用LAMP技术,在65℃温育1 h的条件下扩增溶藻弧菌基因组DNA.琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带.该研究建立的LAMP法特异性检出致病性溶藻弧菌,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于n(cell)=38/mL的菌液浓度,灵敏度更高.综合分析表明,LAMP技术是快速、简易、实地诊断溶藻弧菌的理想工具.     

鱼类营养免疫研究进展

随着集约化养殖模式的推广，鱼类养殖业得到了迅猛发展。然而，由于高密度养殖、投饲频率增加以及水体污染等问题，养殖鱼类感染疾病的几率大大升高，给养殖业造成了巨大损失。因此鱼类病害已经成为制约养殖业进一步发展的瓶颈。传统的用于防治鱼病的方法主要有两种，一是化学药物治疗法；一是疫苗预防法。化学药物治疗存在抗药性和药物残留等问题，而疫苗预防法则由于其特异性和操作困难而存在一定的局限性。因此寻找新的防治鱼类病害的方法就成为人们亟待解决的重大课题。     

副溶血性弧菌脂蛋白定位系统转运蛋白结构与功能的生物信息学分析

【目的】副溶血性弧菌是一种重要的人畜共患病原菌,脂蛋白定位系统(Localization of lipoprotein system,Lol)负责该菌脂蛋白的转运与定位,与其致病力及耐药性密切相关,对Lol系统转运蛋白进行系统的生物信息学分析,有助于推动副溶血性弧菌致病与耐药机理的进一步研究。【方法】本文通过生物信息学分析技术,结合ExPASy在线工具、SignalP 4.0 Server、TMHMM-2.0、STRING、SWISS-MODEL等软件,分析了副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白LolA-E及LolCD_2E的基本性质、蛋白互作关系及三级结构。【结果】LolA和LolB为酸性亲水蛋白,含信号肽位点,无跨膜区域。LolC和LolE为碱性疏水膜蛋白,LolCD_2E为中性疏水膜蛋白,LolC-E及LolCD_2E均无显著的信号肽位点。蛋白相互作用网络显示,LolA–E五个蛋白的编码基因均共表达,负责脂蛋白的合成与转运,并与BamA、Pal、MacB、CmeC等外膜蛋白具有密切的互作关系。三级结构同源建模发现,副溶血性弧菌与大肠杆菌拥有相似的LolA和LolB结构,LolC-E含有MacB蛋白的同源结构,赋予了该系统消耗ATP运输脂蛋白的重要功能。此外,本研究还首次发现了副溶血性弧菌LolC和LolE中存在一段保守的Hook结构,是LolCD_2E复合物与LolA结合并转运脂蛋白的关键区域。【结论】本研究为副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白的表达纯化、结构与功能的研究提供了重要的数据基础,为后续抗菌药物的研发提供了新型作用靶点。     

鱼类革兰氏阴性病原菌外膜蛋白疫苗的研究进展

鱼类细菌性感染作为十分常见且危害严重的一类水产病害,严重阻碍了我国水产养殖业的发展,同时也造成了巨大经济损失,而免疫防治作为一种安全有效的防治方法,正逐步受到人们的关注。外膜蛋白作为革兰氏阴性菌外膜的主要组成成分,不仅在维持细菌正常生命活动中发挥着重要作用,同时具有较强的免疫原性及交叉免疫原性,可以作为潜在的免疫保护性抗原,在渔用疫苗的研发中具有广阔的应用前景。该文介绍了鱼类病原菌外膜蛋白的结构组成、种类功能、免疫原性等基本特性,对外膜蛋白在亚单位疫苗、DNA疫苗、多价多联疫苗及活载体疫苗等渔用疫苗中的应用进行了论述,并从疫苗佐剂应用及铁离子相关外膜蛋白研究等方面展开讨论,以期为外膜蛋白渔用疫苗研发提供参考。     

基于原核表达的副溶血性弧菌类毒素疫苗对海水鱼类免疫保护作用

目的:实现副溶血性弧菌溶血毒素基因tdh克隆与表达,并以表达产物TDH作免疫原,研究其对海水鱼免疫活性的影响.方法:PCR扩增tdh;构建重组质粒(pET-28-TDH);IPTG诱导表达;SDS-PAGE检测:以纯化的TDH融合蛋白脱毒为类毒素免疫原免疫健康真鲷,测定其血清中过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(AKP)活性变化;用副溶血性弧菌病原攻毒,检测免疫保护作用.结果:tdh基因成功克隆并表达;表达蛋白相对分子量为21 kDa,证实为TDH蛋白;类毒素免疫真鲷后,其血清中总超氧化物歧化酶(T- SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和过氧化氢酶(CAT)活力在注射后48h、24h、24h、2Ah达到最高,最高点分别高于对照组77％、328％、75％、381％;72 h后均恢复至对照组水平.结论:类毒素对真鲷免疫系统具有明显的刺激作用;类毒素免疫后对攻毒的真鲷保护率达50％.     

黄鳍鲷弧菌病病原特性及其全菌苗的研究*

自湛江市发病养殖黄鳍鲷分离一株致病菌。对该菌的基本特征、药物筛选、灭活全菌苗等进行了研究。结果表明该病原菌为溶藻弧菌,且对四环素、土霉素、氯霉素、氟哌酸、氧氟沙星等药物敏感,pH6．0比pH8．4时灭活效果好,加入福尔马林可以提高灭活效果;全菌苗能够提高鱼体的免疫能力,减少攻毒时的死亡率。     

梅毒螺旋体外膜蛋白研究进展

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)亚种苍白螺旋菌引起的性传播感染性疾病,主要通过母婴感染或性接触的方式传播。梅毒螺旋体的外膜蛋白在梅毒螺旋体的传播和宿主的黏附等方面起重要作用,因此,鉴定可以作为抗生素作用靶点的梅毒螺旋体外膜蛋白一直是梅毒疫苗开发的研究重点。本文重点阐述了梅毒螺旋体外膜蛋白的结构功能等特性,并将目前针对细菌外膜蛋白为靶点的药物的研究进展进行总结,以期为针对梅毒螺旋体的外膜蛋白为靶点的相关药物的研发提供一些新思路。     

鱼源溶藻弧菌生物学特性和病理组织学观察

【目的】溃烂病是我国海水养殖及南方养殖斜带石斑鱼的常见严重病害之一。通过对患病的斜带石斑鱼病原菌的分离与鉴定,为检测其耐药性和控制石斑鱼在海水养殖中溃烂病的爆发和流行奠定基础。本文目的是研究斜带石斑鱼相关的病原菌的特性。【方法】从患病斜带石斑鱼肾脏、肝脏病灶组织,分离纯化得到病原菌,进行纯化培养、人工感染和回归感染、ATB细菌自动鉴定及药敏试验,并进行菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定。【结果】确定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。两株典型菌株经人工感染和回归感染均显示自然发病症状。药敏试验表明,该菌具有较强的耐药性,在所检测的抗菌药物中,对青霉素等3类抗菌药物高度耐药,而对氯霉素等5类抗菌药物敏感。器官主要组织病理学变化为:肝细胞、肾小管细胞等变性、坏死,病变组织有炎性细胞浸润且呈变质性炎症。溶藻弧菌对机体的主要器官造成严重病理损伤。【结论】生理生化等结果均证实分离菌株是溶藻弧菌,而且产生多重耐药情况较为普遍,未来应加强对养殖海水中病原耐药性和斜带石斑鱼病原感染的监测。