海藻糖生产过程中产酶发酵条件的研究

研究了产酶的培养基组分和比例以及最佳培养条件对微球菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(MTHase)的影响,得到最优培养基组成为：葡萄糖2．0％,酵母膏2．0％,蛋白胨1．0％,磷酸氢二钾0．1％,硫酸镁0．05％;优化后的培养条件为：以15％的接种量接种至250mL的锥形瓶中,装液量为50mL,初始pH值7．5～8．5,培养温度为30℃,摇床培养4d。经优化后菌体干重由原来的1．938g／L增加到18．5g／L,生物量几乎增长了10倍;而酶活也由原来的30．64U／g增加到206．11U／g,酶活提高了接近7倍。     

微生物酶拆分方法生产D-泛酸的手性中间体D-泛解酸内酯

筛选到一株产D－泛解酸内酯水解酶的串珠镰孢霉菌（Fusarium moniliforme SW-902)。产酶条件研究表明,用甘油作碳源,蛋白胨作氮源,初始pH8.0,温度26℃,摇瓶培养3d,产酶量最高。在60L和1000L发酵罐中通风发酵45－47h,产酶量为6－8g干菌体／L,D－泛解酸内酯水解酶酶活力达到0．87－0．92IU／g干菌体。该酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为7．0－7．5。在酶不对称水解泛解酸内酯过程中,对溶液加酶量5％－10％,底物浓度10％－20％,控制水解率20％－30％,水解效果最好。     

植物乳杆菌RS2-2发酵法生产乳酸脱氢酶

筛选到一株产乳酸脱氢酶的植物乳杆菌RS2-2（Lactobacillus plantarum RS2-2）。产酶条件研究表明,以蔗糖为碳源,酵母膏为氮源,起始pH6．5左右,30℃发酵,接种量为10％,产酶量最高。在25L发酵罐放大实验,并通过流加NaOH控制发酵过程中的pH,所产乳酸脱氢酶比活力为18．73U／mg,菌重量为lg／L以上。粗酶液经分离纯化得到成品酶液,比酶活提高了51．7倍,达到1210、7U／mg,总收率为30、2％。用凝胶过滤检测其分子量分布,分子量约为85,000Da,酶纯度为88％。     

白腐真菌AH28-2菌株发酵合成漆酶初步研究

从224个野外采集的真菌样品中筛选分离到一株产漆酶活性较高菌株AH28－2,经初步鉴定为白腐真菌,采用单因子相互比较法,研究了该菌株最适发酵产酶条件。应用添加有1g／LKraft木素的液体发酵培养基,接种量5％（V／V）,初始pH8．5,装液量为50％,28℃、150r/min摇瓶振荡培养4－5d,漆酶酶活水平达20184IU／L。     

黄孢原毛皮革菌降解苯胺的工艺研究

通过正交试验优化筛选了适合黄孢原毛皮革菌降解苯胺的适宜培养基和摇瓶培养降解条件。结果表明：其适宜降解的液体培养基组成为：蔗糖20g／L,可溶性淀粉20g／L,(NH4)2SO4l0g／L,Mn^2 lμmol／L,Tween-800．3％,蛋白胨30g／L。适宜降解的摇瓶培养条件为：接种量为20％、pH为7．0、温度为30℃、培养时间为12d．此条件下的苯胺最高降解率可达95．5％。     

菊糖酶发酵生产条件的研究

脆壁克鲁维氏酵母（Kluyveromycesfragilis）在pH5．5的适当培养基中,28℃摇瓶培养30h后,进行分批发酵。结果表明：发酵初始pH为6．0～6．5,菊糖浓度为2％,接种量4％,控制前期发酵温度为28℃,33h后发酵温度为32～34℃。发酵周期为70h左右,最高产酶达240u／ml。在5L自控发酵罐中,产酶达到同样水平,发酵周期缩短约10h。     

酒精废水发酵生产白地霉

利用糖厂的酒精废水,进行了白地霉的摇瓶培养研究,在单因素试验基础上,得出了白地霉培养的适宜条件,即废水先稀释0．2倍,添加0．2％硫酸铵,0．1％磷酸,0．1％硫酸镁,初始pH值调整为4．5,接种量为10％,28℃-30℃,在这条件下,得到了0．6－0．7％的干物质发酵产率。     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度,在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明,以下条件：初始甘油浓度40g／L、初始甲醇浓度3.1g甲醇／gDCW、每24h添加0.51g甲醇／gDCW、诱导表达周期72h、250mL三角瓶诱导培养基装液量30mL、初始pH6,0,最适于菌体生长与产物表达。在此基础上,7L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度,诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat,发酵结束菌体干重达80g／L,酶活为217U／mL,比摇瓶结果提高了66.2％。     

重组青霉素G酰化酶拆分制备（S）-邻氯苯甘氨酸

对产青霉素G酰化酶的重组枯草芽胞杆菌发酵产酶条件进行优化,确定优化后的发酵条件：可溶性淀粉10g/L、蛋白胨12g/L、酵母粉3g/L、NaCl10g,／L;pH7．5、培养温度37℃、装液量80mL（500mL三角瓶）、培养28h,青霉素G酰化酶的表达水平由最初的7．34U／mL提高至18．23U／mL。以表达青霉素G酰化酶的枯草芽胞杆菌发酵液为酶源,在水相中对映选择性催化N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸制备（S）-邻氯苯甘氨酸,当底物浓度为100mol／L时转化4h,转化率达44．2％。对底物浓度为80mmoL／L反应液中的（S）-邻氯苯甘氨酸进行分离,达到理论收率的94．29％（以N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸的0．5倍摩尔量为理论产率）,e．e．值大于99．9％。170℃条件下,N-苯乙酰-（R）-邻氯苯甘氨酸与苯乙酸共熔消旋为N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸可用于循环拆分。     

高产超氧化物歧化酶菌株发酵条件的研究

从1348株芽孢杆菌(Bacillus cereus)中分离和选育出高产超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)菌株C328,并进行了产酶条件的研究。结果表明,该菌株最佳产酶的最适温度为30～35℃,培养基最适起始pH为8．0～8．5。金属离子Cd^2 、Mn^2 、Zn^2 ,表面活性剂吐温80、司班80、琥珀酸钠和无机盐CaCl2、CaCO3对产酶有抑制作用。适宜浓度的K2HPO4、EDTA、金属离子Fe^3 和表面活性剂NaAC对产酶有明显的促进作用。发酵培养用250mL三角瓶以30mL装液量酶活力最高。适宜种龄为8～12h,适宜接种量为0．9％～3％,最佳接种量为1％～2％。     

影响枯草芽胞杆菌和荧光假单胞菌原生质体再生的因素

目的：为了提高再生率,对影响革兰阳性菌枯草芽胞杆菌KR株和革兰阴性菌荧光假单胞菌B13株原生质体再生的因素进行研究。方法：研究了酶解时间,再生方式,再生培养基中稳定剂的种类,Ca^2＋、Mg^2＋、琥珀酸钠、L-色氨酸的浓度及培养基的放置时间对KR和B13株原生质体再生的影响。结果：对KR株酶解20min,采用夹层培养,再生培养基中加入0.6mol/L蔗糖、0.03mol/L Ca^2＋、0.02mol/L Mg^2＋、0.3mol/L琥珀酸钠、0.2mol/L L-色氨酸,培养基在37℃放置72h,原生质体再生率可达42.7%;对B13酶解15min,采用夹层培养,培养基中加入0.6mol/L NaCl、0.02mol/L Ca^2＋、0.01mol/L Mg^2＋、0.3mol/L琥珀酸钠、0.1mol/L L-色氨酸,培养基在37℃放置48h,原生质体再生率可达15.3%。结论：影响革兰阳性菌枯草芽胞杆菌KR株和革兰阴性菌荧光假单胞菌B13株原生质体再生的因素是不同的。     

产黄青霉菌株39B分离培养及其白藜芦醇代谢积累条件研究

在虎杖组织培养过程中获得1株产黄青霉菌株(Penicillum chrysogenum,39B)菌株,其发酵液经TLC和HPLC检测含白藜芦醇,对其培养条件及白藜芦醇积累特性进行了研究,通过正交优化试验得到该菌最佳培养条件:20g/L葡萄糖,2g/L硝酸铵,pH值7.0,28℃,100r/min。3mmol/L苯丙氨酸、Mg2+、Zn2+能促进其生长和白藜芦醇的积累,其白藜芦醇含量达8.6617μg/100mL。     

正交设计优化东亚砂藓DDRT-PCR反应体系

利用正交实验设计L25（5^6）对东亚砂藓（Racomitrium japonicum）DDRT—PCR反应体系的6因素（Mg^2＋、dNTP、锚定引物、随机引物、模板DNA、Taq酶）在5个水平上进行优化实验。结果筛选出各反应因素的最佳体系（20μL）为：Mg^2＋2．25mmol／L、dNTP0．4mmol／L、锚定引物1．0μmol／L、随机引物0．7μmol／L、模板DNA1．6μL、Taq酶2．5U。对东亚砂藓DDRT—PCR最佳反应体系进行梯度PCR引物退火温度筛选,得到的最佳退火温度为45．4℃。该优化体系的建立,为进一步进行东亚砂藓抗旱基因的筛选与克隆等一系列分子研究提供了重要参考依据。     

产中性纤维素酶耐碱芽孢杆菌的筛选及酶学性质研究

采用CMC碱性平板筛选方法,从造纸厂碱性淤泥中获得产中性纤维素酶的耐碱枯草芽孢杆菌C3004。根据其形态特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus subtilis C3004。液体摇瓶培养24 h产生CMC酶活力达46.6 U/mL。酶学性质初步研究显示,CMC酶反应的pH值以7.0左右为适;在弱酸和碱性条件下也具有较高的酶活和一定的稳定性;反应温度以50℃左右为宜;且具有较好的热稳定性。Mn~(2+)与Fe~(3+)对酶反应有促进作用,Cu~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)对酶反应有抑制作用。该菌可在碱性(pH 8.5～10)条件下培养,具有不易被杂菌污染的特点。     

镁离子对黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成过程的影响

目的探讨镁离子对黏液型铜绿假单胞菌早期黏附和生物膜形成过程的影响。方法荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板底部黏附细菌的荧光强度,荧光探针FTTC-ConA染细菌胞外多糖（Extracellular Polymeric Substances,EPS）、荧光显微镜下观察各组多糖差别;SYTO9／PI染生物膜内细菌、激光共聚焦显微镜观察结合BF图像结构分析软件（Image Structor Analyzer,ISA）对各组生物膜结构参数进行定量分析。结果2d时,空白组和1mmol／L镁组的黏附细菌的荧光强度分别为1845．67±45．3和2254．78±42．45,t=-9．96,P〈0．05;0．1mmol／L的镁浓度下荧光强度也有增加,其余各时间组趋势与2d组相似;在荧光显微镜下观察可见随着镁浓度增加,EPS增多;激光共聚焦显微镜下可见随着镁浓度增加,生物膜活菌增加、菌落变密集;ISA软件分析结果示：空白组和1mmol／L镁组的6d生物膜厚度分别为（25．80±1．16）μm和（34．87±1．59）μm,t=-13．85,P〈0．05;区域孔率分别为0．96±0．05和0．90±0．04,t=2．48,P〈0．05;平均扩散距离分别为1．54±0．15和1．92±0．16,t=5．23,P〈0．05;结构熵分别为3．64±0．57和4．70±1．09,t=-2．6,P〈0．05,3d组生物膜也有相同的趋势。结论镁离子可以增强黏液型铜绿假单胞菌的早期黏附,影响随后生物膜的形成及结构。     

静息细胞转化生产3-羟基丙酸的条件优化

本文研究了静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的反应体系。考察了以甘油为底物,利用静息细胞转化生产3一羟基丙酸的相关因素,确定了最佳的转化条件：细胞浓度20g／L,甘油浓度20g／L,辅酶VB12浓度10mg／L,NAD＋浓度0．15mmol／L,温度35℃,反应体系为0．05mol／LpH7．0Tris—HCl缓冲液。在上述条件下反应6h后,3-羟基丙酸的产量达到为3．17g／L,底物转化率为28．33％。由上述结果可知,采用静息细胞转化法为3-HP的生物合成提供了一种可能的方法。     

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT）基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b（＋）中,构建了表达载体pET-20b（＋）／cgt,并将其转化表达宿主E.coli BL21（DE3）。对重组菌E．coli BL21／pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件：葡萄糖8g/L,乳糖0．5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO472mmol／L,KH2PO417mmol／L,CaCl2 2．5mmol／L;初始pH为7．0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22．1u／mL,与来源菌Pmacerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3L发酵罐中发酵,90h后胞外酶比活达到22．6U／mL,证实了工业化放大的可能性。     

番茄叶霉病菌ISSR-PCR体系的建立

以番茄叶霉病菌(Passalora fulva)基因组DNA为模板,采用单因素试验和正交设计试验对该菌ISSR-PCR体系中的一些重要参数(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、缓冲液、循环次数)和引物进行筛选和优化,并对退火温度进行了梯度优化,建立了番茄叶霉病菌ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,引物1.5μmol/L,模板DNA45 ng,TaqDNA聚合酶1.0 U,1倍的PCR缓冲液,循环40次,退火温度50℃。     

一种3-氰基吡啶水解酶产生菌的高通量筛选策略及应用

利用改进的羟肟酸铁分光光度比色法建立了一种简单、快速、高通量的腈水解酶筛选方法.应用该方法从土壤中筛选获得1株具有3-氰基吡啶水解酶活性的菌株CCZU10 -1,经16S rDNA序列分析,鉴定该菌为红球菌属Rhodococcus sp.;同时确定了最适反应温度、pH和金属离子添加剂分别为30℃、7.0和Ca2+ (0.1 mmol/L).在最适催化反应条件下,催化转化50 mmol/L烟腈36 h,烟酸的产率可达到93.5％.     

白色念珠菌菌丝相培养条件及RAPD反应体系优化的研究

目的优化门色念珠菌菌丝相培养条件,为白色念珠菌菌丝相的分子生物学研究提供必要条件;建立白色念珠菌菌丝相RAPD的最佳反应体系,应用于其基因组DNA扩增。方法在RPM11640培养基的基础上,通过单因素试验研究了小牛血清用量、培养液pH值、培养温度和转种次数等对白色念珠菌菌丝相形成的影响。采用单因素试验,分别研究了Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、Taq酶的浓度、引物浓度和模板DNA浓度对白色念珠菌菌丝相RAPD反应的影响;应用L16（4^5）正交试验对RAPD反应条件进行了优化。结果白色念珠菌菌丝相诱导的最佳条件为：每100ml培养液中的小牛血清用量为10ml,培养液pH值为7．5,培养温度为36℃,转种次数为12次。白色念珠菌菌丝相的最适RAPD反应体系为：Mg^2＋ 1．25mmol／L、dNTPs 0．4mmol／L、随机引物0．1μmol／L、TaqDNA聚合酶5U／50μl、模板DNA495ng／50μl。结论通过单因素和正交试验,获得了较适白色念珠菌菌丝相培养条件和其基因组RAPD扩增条件。