碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度, 在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明, 以下条件：初始甘油浓度40 g/L、初始甲醇浓度3.1 g甲醇/g DCW、每24 h添加0.51 g甲醇/g DCW、诱导表达周期72 h、250 mL三角瓶诱导培养基装液量30 mL、初始pH 6.0, 最适于菌体生长与产物表达。在此基础上, 7 L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度, 诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat, 发酵结束菌体干重达80 g/L, 酶活为217 U/mL, 比摇瓶结果提高了66.2%。     

重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略

重组Pichia pastoris GS115表达碱性果胶酶的诱导阶段, 最佳初始菌体浓度和甲醇诱导浓度分别为122 g/L和20 g/L, 两者之间最佳比值范围是0.16~0.20 g/g (甲醇/菌体浓度). 在此基础上通过生长阶段甘油的指数流加, 以及诱导阶段基于甲醇比消耗速率和溶氧等参数进行甲醇流加的方式, 将甲醇与菌体浓度比例控制在0.171~0.195 g/g之间. 此时, 酶活达到430 u/mL, 生产强度为4.34 u/mL/h, 实现了碱性果胶酶高效生产。     

重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略

重组Pichia pastoris GS115表达碱性果胶酶的诱导阶段, 最佳初始菌体浓度和甲醇诱导浓度分别为122 g/L和20 g/L, 两者之间最佳比值范围是0.16~0.20 g/g (甲醇/菌体浓度). 在此基础上通过生长阶段甘油的指数流加, 以及诱导阶段基于甲醇比消耗速率和溶氧等参数进行甲醇流加的方式, 将甲醇与菌体浓度比例控制在0.171~0.195 g/g之间. 此时, 酶活达到430 u/mL, 生产强度为4.34 u/mL/h, 实现了碱性果胶酶高效生产。     

双碳源流加对重组毕赤酵母高效表达葡萄糖氧化酶的影响

葡萄糖氧化酶(GOD)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了实现葡萄糖氧化酶的高效生产,提高重组毕赤酵母生产GOD的产量和增强生产强度,对重组毕赤酵母诱导阶段的初始菌体浓度和甲醇浓度进行了优化.在此基础上,诱导期采用了双碳源(甘油、山梨醇和甘露醇)与甲醇混合流加的模式.研究发现,最佳诱导前初始菌体浓度和甲醇浓度分别为100 g/L和18 g/L,此时GOD产量为427.6 U/mL.在诱导阶段采用甘油、山梨醇和甘露醇与甲醇的混合添加均可以提高GOD产量,其中甘露醇与甲醇的混合流加效果最为显著.当甲醇与甘露醇混合流加的比例为20∶1(W/W)时,诱导156h GOD产量和生产强度分别可达711.3 U/mL和4.60 U/(mL·h),比甲醇单一流加策略结果分别提高了66.3％和67.9％.此外采用合适的甘露醇混合流加策略不但不会抑制AOX1启动子的表达,甚至有一定促进作用,AOX酶活性为8.8 U/g(对照为5.2 U/g).双碳源流加方式还能推广到毕赤酵母其他表型中,为该系统高效表达外源蛋白提供一种新策略.     

混合碳源流加对重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的影响

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(PGL)的产量和生产强度,在诱导期采用多种碳源与甲醇混合添加的模式。实验结果发现:甘油、山梨醇、乳酸与甲醇的混合添加均可以提高PGL的产量,其中山梨醇与甲醇的混合流加效果最为显著。研究表明,通过双碳源混合流加可以提高细胞活力,增强醇氧化酶活力,提高毕赤酵母表达外源蛋白效率。当山梨醇的流速为3.6g/(h·L)时,PGL酶活可达1593U/mL,生产强度为16.7U/(mL·h),比对照分别提高了84.6%和45.2%,实现了碱性果胶酶的高效生产。     

重组人干扰素ω在对数生长期毕赤酵母中的高效表达特性研究

用不同比生长速率μ的毕赤酵母探讨其表达外源重组蛋白的差异性,通过起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、菌体浓度、装液量等实验,优化具有较高μ的对数生长期毕赤酵母表达rhIFNω的摇瓶条件。结果表明,μ对毕赤酵母表达rhIFNω有显著影响。μ为0.1612h-1的毕赤酵母表达rhIFNω最高为558mg/L,较μ为0.1321、0.0505和0.0052h-1的毕赤酵母分别提高50%、68%和99%。对数生长期的毕赤酵母表达rhIFNω的最适摇瓶表达条件为:250mL摇瓶装入30mL BMMY,控制菌体浓度达到200~300g/L(WCW),起始pH值自然,每24h添加甲醇15g/L一次,诱导表达周期为4d。通过表达条件的优化,rhIFNω的表达量达到1070mg/L,较优化前提高149%。     

重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究

为提高重组毕赤酵母(P.pastoris KM71/pPIC9K-bgl)生产β-葡萄糖苷酶的产量,在摇瓶条件下对重组P.pastoris产β-葡萄糖苷酶的发酵过程进行了优化,得到最佳的条件:生长阶段甘油浓度为30 g/L,接种量为10%,诱导阶段甲醇的初浓度为4%,过程补加甲醇0.5%,诱导温度30℃,pH7.5,诱导周期120 h,酶活可达到245 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行初步放大,流加甘油提高细胞密度至OD_(600)为170,开始流加甲醇诱导,最终BGL酶活达到1 175 U/mL。比摇瓶提高了4.8倍,为β-葡萄糖苷酶工业化生产打下了坚实的基础。     

产HSA—CP融合蛋白毕赤酵母的发酵条件优化

为提高重组毕赤酵母生产人血清白蛋白-C肽融合蛋白（HSA—CP）的产量和生产强度,在摇瓶条件下考察了甲醇诱导时间和浓度对目的蛋白产量的影响。结果表明,质量浓度10g/L的甲醇诱导72h最适于产物表达。通过对7L发酵罐中各因素的优化,得到最佳条件为：初始甘油质量浓度10g/L,30℃培养,菌体生长期和诱导期的pH及溶氧分别控制在pH5．0、30％溶解O2或pH6．0、15％的溶解O2。10g/L的甲醇诱导72h,最终使干细胞质量浓度达到56．43g/L,目的蛋白产量达368．45mg／L。生产强度为3．920mg/（L·h）,目标蛋白的比生产速率为5．12mg/（L·h）。     

酵母表达肌肉生长抑制素前肽发酵工艺的优化

突变型肌肉生长抑制素前肽（MMP）在治疗肌肉萎缩症和培育多肌肉牲畜上有着广泛的应用前景。以重组表达MMP的毕赤酵母工程菌为模式,对该工程菌在30L发酵灌中培养与诱导备件进行优化,建立该表达系统大规模发酵的最佳生产条件,以期荻得最短的发酵时间和最低的生产损耗。毕赤酵母发酵过程通常分为3个阶段：分批培养（基础培养）阶段、分批补料培养阶段、诱导阶段。对发酵过程的第2与第3阶段进行了优化。通过分步提高甘油流加速度：以20mL／L·h^-1的速度流加5h、以30mL／L·h^-1的速度流加5h、以50mL／L·h^-1速度流加14h,并通入纯氧气,维持60％的溶氧度,使甘油流加阶段的时间从常规的48h缩短至24h,即只需24h即可达到常规方法48h才能达到的菌体密度。在诱导表达阶段,通过甘油与甲醇的交替流加,同时对发酵液中甲醇含量的实时监测,保持甲醇的浓度不超过0．5％的高限,使诱导的时间从常规的72h缩短至36h,而且表达量提高了约1倍。优化后,整个发酵周期从120～148h缩短至72～80h,显著提高了MMP蛋白的生产效率。     

毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究

对摇瓶和50L罐上的重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris)表达猪胰岛素前体(PIP)的发酵过程进行了研究。摇瓶发酵中,最佳诱导周期为60 h左右,诱导期甲醇的最佳加入量为每日2．0%～2．5%。50L发酵过程分为批发酵、补料和诱导表达3个阶段。生长期(批发酵和补料阶段)细胞干重与培养时间的关系可用模型y= 0．6525e~(0．1909t)来描述。在批发酵阶段和补料阶段,流加的氨水和甘油几乎全部用来合成菌体和维持,没有其他副产物产生。诱导表达阶段流加的氨水和甲醇分别约有80%和70%被菌体利用。将摇瓶与发酵罐的实验结果进行了比较,发现摇瓶发酵的限制因子很可能是溶氧,而罐发酵的限制因子为碳源,因此,将摇瓶实验的结果放大到发酵罐时调整了控制策略,加大了甲醇的补料速率,最终PIP浓度达到1．72g/L。     

恒细胞密度发酵策略提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的表达效率

为了提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(Alkaline polygalacturonate lyase,PGL)的比速率,开发了一种新的恒细胞密度发酵策略。通过不同的甲醇流加方式,实现发酵过程细胞密度的合理控制。实验结果表明:控制细胞密度为75 g/L的策略为最优,最终单位发酵液体积生产强度和单位菌体生产强度为6.11 U/(mL.h)和81.5 U/(g.h),分别比传统高密度发酵提高了42.1%和191.2%,最终PGL酶活为441.9 U/mL。此外,该策略还具有提高细胞活性和降低蛋白酶降解作用等优势。     

Enhancement of alkaline polygalacturonate lyase production in recombinant Pichia pastoris according to the ratio of methanol to cell concentration

Polygalacturonate lyase (PGL) production by Pichia pastoris GS115 was used as a model to study the mechanism and strategy for enhancing heterologous protein production. It was found that the ratio of methanol to cell concentration had a significant influence on PGL production. In this study, an advanced glycerol exponential feeding strategy was developed for biomass accumulation in cell growth phase, by which cell concentration reached 140 g L(-1) after 19 h glycerol feeding. In subsequent production phase, a methanol feeding profile was proposed according to the optimal ratio of methanol to cell concentration at a range of 0.163-0.171 g g(-1), and PGL activity and productivity reached 430 U mL(-1) and 4.34 U mL(-1)h(-1), respectively. The strategy for enhancing PGL production by controlling the optimal ratio may provide an alternative approach to enhance heterologous protein production with P. pastoris.     

A new fermentation strategy for S-adenosylmethionine production in recombinant Pichia pastoris

A recombinant Pichia pastoris MutS expressing SAM2 gene of Saccharomyces cerevisiae was cultured for S-adenosylmethionine (SAM) accumulation. Effect of the amount of methanol added (0.5%, 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 6.0%, 10.0%, and 12.0%) and cell densities (9.57, 13.47, 21.74, 30.90, and 41.24 g/L dry cell weight (DCW)) on yield of SAM was found in flask cultivations. In flask experiments, maximal yield of SAM (1.29 g/L) was obtained at 2.0% methanol added and 30.90 g/L DCW which gave the maximal methanol consumption rate. Conjunct effect of amount of methanol added and cell density was found through Origin 7.0 (7.0 Microcal, USA). Scale up in 3.7 L bioreactor, 51% specific yield of SAM was enhanced at 0.6% methanol compared to that of 0.1% methanol. In fed-batches of different cell densities at 0.6% methanol, maximal yield of SAM was 8.66 g/L at 100 g/L DCW with 64% yield of SAM enhanced again. Methanol consumption rate at 100 g/L DCW was 4.81 mL/L h. Maintenance coefficient of 100 g/L DCW was lower than that of others significantly, although methanol consumption rate of 90 g/L DCW was higher (5.07 mL/L h) than that of 100 g/L DCW.     

甘油及甲醇补料策略对毕赤酵母表达猪α-干扰素的影响

本文研究了甘油及甲醇补料策略对重组毕赤酵母细胞生长及猪α-干扰素(p IFN-α)表达的影响。结果表明,甘油采取不同的补料策略,以及甲醇浓度控制于不同水平时,细胞生长速度不同,p IFN-α抗病毒活性水平也明显不同。高密度发酵阶段,甘油采用指数方式流加控制时,相较于40 g/L/h、10 g/L/h,恒速流加组的细胞浓度最先达最高水平132 g/L,后一直保持稳定,且发酵液中几乎无残留甘油;与之相应的p IFN-α抗病毒活性水平最高。诱导表达阶段,甲醇浓度须控制并恒定于12 g/L时,p IFN-α抗病毒活性最高水平能达到5.95×106IU/m L,而当甲醇浓度稳定于3.5 g/L、16.0 g/L、或者浓度波动较大(10.2~13.8 g/L)时,p IFN-α抗病毒活性均远低于最高水平。     

发酵条件对毕赤酵母表达重组人干扰素ω糖基化的影响

发酵条件是影响毕赤酵母 (P .pastoris)表达外源重组糖蛋白时糖基化的重要因素。通过菌体浓度、起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、装液量等摇瓶发酵实验 ,研究不同发酵条件对毕赤酵母表达分泌型重组人干扰素ω(rhIFNω)过程中糖基化的影响 ;同时 ,在连续培养过程中考察pH值变化对rhIFNω糖基化的影响和分批发酵过程中rhIFNω糖基化的变化。结果表明 ,控制菌体密度 250g L(WCW)、起始pH值 6 0、装液量小于 30mL、甲醇诱导浓度 15g L、甲醇诱导 3次 (每 24h诱导一次 )等发酵条件 ,有利于摇瓶发酵过程中rhIFNω的糖基化 ;控制pH值 70～75可促进rhIFNω的糖基化 ;分批发酵过程中 ,糖基化与非糖基化rhIFNω的含量有同比变化趋势 ,但糖基化rhIFNω所占比例明显低于摇瓶发酵实验的结果 ,其原因有待进一步研究。     

以葡萄糖为生长相基质的重组毕赤酵母表达植酸酶发酵

甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白是在醇氧化酶（alcohol oxidase,AOX）启动子（PAOXI）严格调控下进行的,然而这种启动子在转录水平受到葡萄糖的阻遏。本文研究了毕赤酵母在葡萄糖替代甘油为生长相碳源时表达重组植酸酶蛋白的发酵特征。结果表明：初始葡萄糖浓度为20dL的细胞得率高,为0．39g[DCW]／g。通过基于实时参数（溶氧和呼吸商）调控的葡萄糖补料策略,生长相40h后细胞密度达到100g[DCW]／L,甲醇诱导100h后植酸酶产量达到2200FTUphytase／mL,甲醇得率系数为0．25FTU phytase／gmethnol。因此,在毕赤酵母高表达重组蛋白培养中葡萄糖能够用作生长相基质,并能实现重组蛋白的高效表达。