牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。     

马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定

以马IgM、luG作为免疫抗原,以此免疫BALB/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2.0)融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选,结果获得了4株分泌抗马IgM和2株分泌抗IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞,特异性试验证明,4株IgM单抗有很好的特异性,仅与马的IgM特异反应,而不与IgG反应;这4株单抗分别命名为IgM4H、IgM6B、IgM8A和IgM12F.经鉴定,IgM4H、IgM6B、IgM12F株为IgG1亚类,IgM8A株为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条.杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA都具有较高的效价,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体.2株IgG的单克隆抗体有很好的特异性,只与IgG反应,而不与IgM发生交叉反应.     

人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体并鉴定其特性。方法：应用杂交瘤融合技术,以重组人凝血因子Ⅶ为抗原免疫BALB／c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化。结果：获得了3株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞3E8、3D2和1C5,诱生的腹水效价分别为1：1×10^7、1：1×10^6和1：1×10^6;亚类鉴定表明388为IgG2a,其余2株均为IgGl;特异性鉴定显示它们与多种血浆蛋白均无交叉反应,表明单抗是特异的;经过亲和层析,获得了纯化的单抗。结论：获得了特异性的人凝血因子Ⅶ单克隆抗体,为建立人凝血因子Ⅶ检测及纯化方法奠定了基础。     

抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的制备及双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法的建立

目的：制备针对嗜肺军团茵血清8型的单克隆抗体,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。方法：用甲醛灭活的嗜肺军团菌血清8型菌免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法。结果：研制出8株能特异性分泌抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Ig类型分别为IgM（2株）、IgG,（1株）和IgG,（5株）;利用IgG1型单抗6G10与6C7配对,建立了双抗夹心ELISA检测方法,该方法的最低检出浓度为2．6×10^5cfu／mL,除与金黄色葡萄球菌有微弱的交叉反应外,与14株其他血清型嗜肺军团菌、17株非嗜肺军团菌及11株非军团菌均无交叉反应,具有较高的特异性。结论：制备了具有高特异性和亲和力的抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,并建立了双抗夹心EUSA检测方法。     

电融合产生黄瓜花叶病毒的单克隆抗体

用提纯的黄瓜花叶病毒(CMV)种传SS-30株和豇豆株(P株)混合免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0,用BAEKON 2000基因转移仪使其融合。通过2—3次简易、快速的有限稀释,获得6个能持续分泌抗体的杂交瘤细胞株,所获抗体分属IgG．和IgG∽井能诱导高滴度腹水抗体。间接ELISA试验证明这些单克隆抗体对种传CMvss一30株、P株和非种传CMV的黄化、日本、山东、香蕉。向日葵和Q等分离物有特异性反应,与c,·分离物的反应性较弱,而对花生矮化病毒(PSV)无交叉反应。利用间接ELISA测定了几个单克隆抗体的亲和力常数。单克降抗体C7H3、A6H4与G4G4、G4H5所抗的抗原决定簇相距较远,而C2H3 与A6H4 G+G8与G4H4为抗同一抗原决定簇的草克隆抗体。     

SIVp27单克隆抗体的制备和鉴定

[目的]建立SIVp27杂交瘤细胞株,并对其分泌的SIVp27单克隆抗体进行初步鉴定。[方法]使用基因重组的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定;采用Westernblot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类,对单克隆抗体进行鉴定。[结果]获得四株可稳定分泌SIVp27单克隆抗体的杂交瘤细胞,1C3、2B6为IgG1类,2E12为IgG2b类,3G3为IgG2a类。四株单抗均能识别SIV的p27蛋白,与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应,2B6、2E12与HIVp24有交叉反应。免疫荧光法检测腹水效价为1:10240~40960。1C3、2B6、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101。2E12与3G3识别不同的抗原表位。[结论]成功地制备出四株SIVp27单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行SIV/SAIDS及其艾滋病相关研究,奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白E2单克隆抗体(MAb),利用原核表达并且纯化的重组糖蛋白E2(rE2)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BVDV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗E2特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3与1G11.用4E3与1G11杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rE2及BVDV包被的ELISA测得的效价分别是6.21×106和6.83×105及6.83×105和7.5×104.间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定4E3与1G11均为IgM/K.特异性试验表明4E3与1G11这2株MAb均不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型反应;其中4E3不与猪瘟病毒反应,而1G11则可与猪瘟病毒发生交叉反应,这种反应特性可试用于BVDV与猪瘟病毒的鉴别诊断.所制备的4E3与1G11 MAb可以用于BVDV抗原的检测,为建立检测BVDV E2蛋白血清抗体的ELISA奠定了基础.     

幽门螺杆菌尿素酶B单位DNA疫苗的构建及鉴定

报告了利用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗呼吸道合胞病毒蛋白的鼠单克隆抗体。获得 7株分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 :IF12 ,4H10 ,1D8,2B2 ,1G8,4G6 ,2D2。其中IF12 ,4H10 ,1D8,2B2 ,4G6分泌的抗体类别为IgG1,1G8为IgG2a ,2D2为IgG2b。经免疫印迹分析证实单抗 1F12 ,2B2识别病毒 4 4ku的蛋白 ,单抗1G8识别 37ku蛋白 ,2D2识别 2 1ku的病毒蛋白 ,单抗4G6识别病毒 90ku蛋白。对单抗的生物学活性进行了分析 ,单抗 4G6对呼吸道合胞病毒有明显的中和作用 ,小鼠腹水的中和滴度为 1∶32 ,其余各单抗中和滴度均小于1∶4。…     

抗酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)单克隆抗体制备

【背景】基于本实验室已经建立的脂环酸芽孢杆菌检测和鉴定方法工作基础之上,以期建立具有很好的经济价值和实用价值,且更为方便、快捷、准确、特异、灵敏的检测方法。【目的】实现对果汁生产中脂环酸芽孢杆菌从原料到成品的快速检测和鉴定。【方法】采用杂交瘤细胞技术,以Alicyclobacillus acidoterrestris(ATCC49025)免疫BALB/c小鼠,用建立的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,得到了3株能稳定分泌A.acidocaldarius抗体的杂交瘤细胞株,其中两株为Ig G1亚类,并对其进行生物学特性的鉴定。【结果】得到的两株单抗3F7和9C4是针对不同的抗原位点,且多次传代后稳定性基本保持不变;特异性实验表明两株单抗均不与A.acidocaldarius(NCIMB11725)、Bacillus cereus(ATCC11778)、Bacillus subtilis(ATCC11774)、A.cycloheptanicus(ATCC49029)等发生交叉反应。【结论】3F7和9C4这两株单抗可以进一步用于检测胶体金试纸条的研制。     

牛IFN-γ原核表达、单克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立

实验旨在建立牛重组IFN-γ(BovIFN-γ)的ELISA检测技术,为牛传染病的免疫学诊断提供新方法。PHA刺激体外培养的奶牛外周血白细胞,从培养细胞中提取总RNA,经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ基因cDNA,进一步克隆至pET28a,转化大肠杆菌,经IPTG诱导,表达出预期大小(18kD左右)组氨酸标记蛋白,经鉴定为BovIFN-γ;以纯化的重组BovIFN-γ为免疫原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得4株能稳定分泌抗BovIFN-γ单克隆抗体的细胞株,分别命名为A7、A10、G6与G10。免疫球蛋白亚类鉴定证明杂交瘤细胞所分泌的抗体均为IgG1,腹水效价在1∶210×100~1∶211×100之间。Western-blot分析显示,4株单抗均能特异性结合重组BovIFN-γ。ELISA试验表明,4株单抗只与融合蛋白BovIFN-γ反应,而不与非相关性蛋白Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF等发生反应。选取A10细胞株分泌的单克隆抗体、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,建立了检测BovIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。实验结果表明,此方法检测敏感性达到2ng/mL,特异性良好,为进一步建立灵敏、特异的病原感染诊断方法奠定了基础。     

抗禽流感病毒H5N1亚型单克隆抗体制备初报

目的制备禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体,为相关研究提供工具。方法以禽流感H5N1亚型病毒免疫BALBc小鼠,取其脾细胞和SP20细胞融合,用血凝抑制试验(HI)和酶联免疫反应(ELISA)检测培养上清,并将阳性融合细胞稀释克隆化3次直至100%孔均为阳性,筛选阳性克隆株,运用免疫荧光法评估单克隆抗体检测病毒感染的犬肾细胞(MDCK)。结果得到三株稳定分泌抗体的细胞并命名为F8、F9、G11,抗体亚型鉴定结果分别为IgG1、IgG2a和IgG2b;在免疫荧光法单克隆抗体能够检测出感染MDCK细胞的病毒。结论建立了3株抗禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体细胞株,其产生的一株高特异性的McAbG11能够用于H5N1亚型禽流感病毒感染诊断,并可能应用于禽流感病毒H5N1亚型感染的防治。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的研究

牛病毒性腹泻——粘膜病是世界性广泛流行的奶牛和肉牛的传染病。其病原为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),属于披膜病毒科的瘟病毒属,它的许多生物学特性至今还不很清楚。本试验建立了12株分泌抗BVDV的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并结合免疫转移电泳法和放射免疫沉淀法,初步研究了BVDV的多肽。     

抗胆汁螺杆菌单克隆抗体的制备

目的制备抗胆汁螺杆菌单克隆抗体（McAbs）。方法用胆汁螺杆菌B2m株皮下免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行融合。以酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选抗胆汁螺杆菌单克隆杂交瘤细胞株并初步鉴定其特异性;免疫印迹试验测定单抗所结合的抗原表位;免疫双向扩散试验确定IgG亚类;腹腔接种法、辛酸-硫酸铵盐析法大量制备、纯化单克隆抗体。结果经过ELISA筛选获得11个阳性杂交瘤细胞株,其效价最高达1：4×10^5以上,并与实验动物常见的15种病原菌呈阴性反应;IgG亚类为IgG2a和IgG2b;免疫印迹试验显示,6株（A-F）与胆汁螺杆菌大约相对分子质量（172、0、21、30、52、66）×10^3的抗原特异结合,5株（G-K）皆与胆汁螺杆菌、幽门螺杆菌等三种螺杆菌大约相对分子质量（52、82）×10^3的抗原呈阳性反应,表明A-F株针对的是胆汁螺杆菌特异性抗原,G-K株可能具有属特异性。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,所结合的抗原为胆汁螺杆菌或螺杆菌的免疫优势抗原,为进一步的种、属生物学特性研究、菌株分型及血清学检测方法建立等奠定了基础。     

长角血蜱卵黄蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为研究蜱类的卵黄发生及其机理,用长角血蜱Haemaphysalis longicornis卵黄蛋白（vitellin, Vn）免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经3次克隆化筛选,获得6株能稳定分泌抗Vn的单克隆抗体（McAb）,即1B5,2A7,2B8,2F2,3A1和3G1。1B5,2B8和2F2亚型为IgGA;2A7亚型为IgG1;3A1和3G1亚型为IgG2a。6株McAb均具有高度特异性,效价在1∶10.5以上。选取效价和特异性最好的1株抗体1B5进行SDS-PAGE分析和亲和力测定,测得1B5重链和轻链的分子量分别为58 kD和21 kD,亲和常数为2.8993×10^-6。Western免疫印迹分析发现6株单抗均与Vn的8个亚基发生免疫反应。本研究成功制备了6株抗长角血蜱Vn的单克隆抗体,为深入阐明长角血蜱卵黄发生的过程与调控机理提供了重要的工具。     

抗丙肝病毒核心抗原单克隆抗体的研制与初步鉴定

用基因工程重组技术获得的丙肝病毒（ＨＣＶ）核心蛋白抗原与鼠血清白蛋白交联后免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,用杂交瘤技术成功地建立了４株稳定分泌抗核心抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞,试验结果表明,该４株ＭｃＡｂｓ与免疫抗原及核心区Ｃ３３肽、ＣＰ９、ＣＰ１０抗原有较强的抗原－抗体反应,与ＨＣＶ ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５无反应,在竞争ＥＬＩＳＡ中,对ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。４株ＭｃＡｂｓ中３株为ＩｇＧ２     

分泌抗加压素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立(之一)

基于深入研究加压素在体内的作用的需要,特制备其单克隆抗体。以赖氨酸加压素为抗原免疫小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出两株特异性高的杂交瘤细胞,产生的抗体对赖氨酸加压素有强的结合反应,对精氨酸压素有一定的交叉反应,对催产素基本无反应。鉴定证明,此抗体属IgG1亚类,为纯的、均一性的单克隆抗体。     

禽网状内皮组织增殖病病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及其识别区分析

为了制备禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)gp90蛋白的单克隆抗体,应用His-gp90融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过筛选、3次亚克隆后获得3株稳定分泌抗REV-gp90蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为3G5-B8、3G5-A10和1G12。经间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测,单克隆抗体的亲和力解离常数(Kd)分别为6.483×10–10、4.844×10–10和9.330×10–10,3株单抗的亚型分别为Ig G1、Ig G1和Ig G2b。经Western blotting和间接免疫荧光实验检测,3株单抗均能识别REV感染DF-1细胞后产生的gp90蛋白。以Western blotting方法利用单抗检测不同截短的gp90蛋白,初步确定3G5-B8和3G5-A10 2株单抗抗原识别区均位于gp90蛋白第200-245位氨基酸,而1G12株单抗识别区包含第230-235位氨基酸。这些单抗为REV的诊断和致病机理研究奠定了基础。     

Identification of goat allotypic determinants and generation of goat-mouse hybridomas secreting goat IgG2

Five allotypic determinants controlled by independent genes have been identified in goat. Of these determinants, four have been detected with alloimmune antisera and one with monoclonal antibodies. The specificities A1, C1 and D1 are lipoproteins; B1 is possibly an alpha 2 macroglobulin and E1 and IgG2. The specificity B1 is not expressed until the age of 3-4 months. The gene controlling the specificity E1 is present at about the same frequency (0.38-0.41) in goat, sheep, cattle and water buffalo. Stable hybridomas secreting goat IgG2 have been obtained by the fusion of goat peripheral lymphocytes with mouse myeloma cells.     

建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。