冷冻干燥对重组酵母乙型肝炎疫苗效力(抗原性)的影响

重组酵母乙型肝炎疫苗(酵母乙肝疫苗)加入保护剂后冷冻干燥,观察是否影响疫苗抗原性和稳定性。按5％和1％的比例,在酵母乙肝疫苗原液中分别加入蔗糖和明胶,低温冷冻干燥,制备3批冻干疫苗,分别进行体外相对效力和小鼠ED50测定。加保护剂冻干后酵母乙肝疫苗体外相对效力和小鼠ED50值较冻干前改变不大,而4℃放置和热加速后的稳定性均优于液体疫苗。因此现有酵母乙肝疫苗加入保护剂冻干后,显著提高了疫苗的稳定性,为进一步制备稳定的疫苗参考品打下了初步基础。     

保存温度和时间对狂犬病疫苗效力稳定性的影响

对人用精制狂犬病疫苗和浓缩狂犬疫苗分析在－33℃,2－8℃,25℃,37℃保存0－6个月进行效力的稳定性观察,结果表明随存放时间及温度增加,两者的生物活性均有不同程度的降低。在2－8℃条件下疫苗的效力明显比其它温度稳定（P＜0．02）;精制疫苗与浓缩疫苗比较,其效力有更稳定的趋势。     

一种乙肝表面抗原结合蛋白可作为疫苗佐剂

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein, SBP)是本实验室发现的一种可以与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合的人源蛋白,该蛋白已经被证实具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用.目前,我们已经利用毕赤酵母表达系统获得了能够分泌表达SBP的毕赤酵母表达菌株.本研究通过对上述菌株的发酵产物进行超滤和亲和层析纯化,获得了一定量的高纯度重组SBP蛋白,并利用酶联免疫吸附检测(ELISA)法和表面等离子体共振(SPF)法分别对重组SBP进行了体内外生物学活性的初步检测,证实其具有与HBsAg结合的能力,并求得了二者之间的亲和常数.将重组SBP作为乙肝疫苗增效剂与乙肝疫苗共同免疫小鼠,SBP增效组小鼠与对照组相比,血清中HBsAg抗体显著升高,表明SBP在体液免疫方面对乙肝疫苗具有显著的增效作用.上述结果表明,SBP有望作为乙肝疫苗的免疫佐剂,在乙型肝炎防治方面有重要意义.     

浦乳动物细胞分泌的乙型肝炎病毒表面S＋PreS1融合抗原的理化和生物学性状

研究了哺乳动物细胞（转基因GdSS1-18细胞系）分泌的乙型肝炎（乙肝）病毒表面S＋PreS1融合抗原（SS1）纯品的理化及生物学性状,结果表明,经HPLC柱层近呈现一个对称峰,证明HBsAg颗粒所带电荷的均一性;SDS－PAGE出现P24及P27条带,未出现Gp30的条带,凝扫描分析其各条带分别各占22．3％,77．7％、0％、Western blot试验证实,P27和Gp30能与S及S1抗体结合,而P24条带仅能与S抗体结合,表明,S、PreS1是特异性条带;N－末端的氨基酸序列和与所用目的基因编码的序列相同;乙肝SS1融合抗原在4℃储存较稳定。动物实验结果表明：与单纯含S基因的参比疫苗相比,含SS1融合基因疫苗免疫Balb/c小鼠既产生S抗体,又产生S1抗体,S抗体的ED50滴度与参比疫苗相似,S1抗体产生早于S抗体。     

牛凝乳酶的结晶及其二硫键的化学修饰

为了配合凝乳酶的蛋白质工程,围绕酶的纯化,结晶和二硫键的化学修饰进行了研究。实验结果表明采用FPLC Mono Q柱代替DEAE-纤维素柱层析可以提高同工酶A,B及其降解组分C的分离效果并缩短纯化时间。以10mg／ml的纯凝乳酶B为出发材料,在4℃1．4—2．0mol／L氯化钠条件下进行培养可以获得外形近似为正立方体晶体。化学修饰的结果证明,凝乳酶的三对二硫键处于酶分子不同的空间部位。0．72mmol／L DTT在Ph6．3条件下能还原处于分子表面的一对二硫键,经溴化氰降解分肽测定为Ｃys²⁵⁰-Cys²⁸³,还原后引起活力下降25％。在二硫键之间引入汞原子其活力与还原酶,羧甲基化酶的活力大体相同,说明Cys²⁵⁰-Cys²⁸³在维持凝乳酶具有活力的空间构象中起着一定的作用。     

pH和溶解氧浓度对重组酵母表达乙型肝炎表面抗原的影响

观察酵母基因工程菌生产目的基因表达产物——乙型肝炎表面抗原的发酵,细胞生长和乙型肝炎表面抗原表达是两个相互影响的过程,因此,存在着pH的调节序列。溶解氧浓度的控制对重组质粒稳定性以及目的基因的高表达具有较大影响,实验获得控制溶解氧浓度为70％饱和度的条件,可使重担质粒保持73％以上的稳定性,并且．乙型肝炎表面抗原达到98．6的相对浓度。     

新生儿接种流感嗜血杆菌乙型肝炎偶联疫苗（COMVAX^TM）的安全性和免疫效果研究

将出生时接种过重组酵母乙肝疫苗的131名HBsAg阴性母亲的新生儿,随机分为两组,一组接种COMVAX^TM,另一组接种单价乙肝疫苗和单价流感嗜血杆菌偶联疫苗,出生时第一针乙肝疫苗接种后,应用2,4,13月程序免疫,在2,4月免疫后,接种COMVAX^TM组和对照组新生儿中无一例发生重度副反应,接种COMVAX^TM组新生第一针免疫前（2月）和二针免后一个月（5月）的抗－HBs阳转率分别为53．73％和95．00％,抗全GMT分别为104．10和56．29,均与接种单价组无显著差异,第二针免疫后一个月接种COMVAX^TM组96．00％新生儿抗－PRP抗体达到长期保护临界值（1.0ug/ml)水平,而接种单价流感嗜血杆菌疫苗组新生儿为95．20％,结果表明,对于健康母亲所生的新生儿,接种COMVAX^TM疫苗,抗－HBs和抗－PRP抗体阳转率及滴度均不低于接种单价疫苗组。     

影响豌豆Rubisco组装的因子及其作用机制

将新鲜制备的不含Rubisco的豌豆叶片低分子量（LMW）蛋白组分在离体条件下室温保温48h后,经ND－PAGE分析发现,ATP和Mg^2 是组装的必需条件。随着Mg^2 浓度的增加,组装成的Rubisco量逐渐增加,直至其浓度到2．5mmol/L后达到平衡。K^ 对组装有抑制作用,抑制程度随着K^ 浓度增加逐渐增强,当K^ 浓度为5mmol/L时组装被抑制56％,当K^ 浓度达到40mmol/L时,组装被抑制高达90％以上;但同样浓度的Na^ 则没有抑制作用。另外,以羟自由基对豌豆LMW蛋白组分中的大亚基进行降解处理,对大亚基专一性降解肽谱与对全酶中和相同,也能产生37kD的降解肽段,而且,预先经ATP和Mg^2 处理的样品,LMW组分中37kD的大亚基降解条带会消失,而在20－30kD位置附近产生新的降解条带;而K^ 预处理同样能够产生20－30kD大亚基的降解条带,但其37kD的大亚基降解条带没有消失,这说明K^ 对组装的抑制作用可能是通过与组装中间体结构后产生不利于组装的构象变化实现的。     

重组单链胰岛素在含有巯基试剂的变性剂中的解折叠

重组单链胰岛素(PIP)含有3对二硫键。在含有巯基试剂的变性剂中,PIP产生二硫键交换从而形成一系列具有不同解折叠程度的二硫键异构体混合物。分别用高压液相色谱（HPLC）和圆二色性（CD）光谱分析了PIP在含有0．2mmol/L2－巯基乙醇的尿素和盐酸胍中的解中的解折叠程度。PIP二硫键异构体混合物通过胰蛋白酶酶解并用质谱测定酶解片段的分子量,证明PIP确实产生了二硫键交换。同时还分离纯化了PIP的一种主要非天然二硫键异构体并研究了它重新折叠成天然构象的情况。观察到PIP只有一种热力学稳定的二硫键配对方式,PIP的非天然二硫键异构体在巯基试剂存在的条件下可以高效转化为天然二硫键配对。还将PIP解折叠和再折叠的情况与胰岛素样生长因子－I（IGF－I）及胰岛素做了比较：胰岛素和PIP只折叠成一种热力学稳定的三级结构,IGF－I却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体;胰岛素的双链重组需缓慢进行,而PIP却可以快速折叠。     

黑皮扁豆凝集素提纯及部分性质研究

采用NaCl抽提、硫酸铵分部沉淀和2步离子交换法从黑皮扁豆中纯化得到一种甘露糖专一凝集素(DPL)。在非变性电泳中纯化的DPL只有一条蛋白带,在还原及非还原条件下的SDS-PAGE中呈现两条蛋白带,其分子量分别为36．8kD和39．8kD;利用FPLC经Sephacryl S-300凝胶过滤测得其表观分子量为155kD,表明DPL由2个α亚基和2个β亚基组成,无二硫键。DPL的等电点为pH6．18,含1．6％糖,为酸性糖蛋白。DPL的热稳定性和pH稳定性,与已报道的甘露糖/葡萄糖专一的豆科凝集素相似。     

Validation of a new alternative for determining in vitro potency in vaccines containing Hepatitis B from two different manufacturers

Facing the discontinuation of the Auszyme kit, an alternative is needed for determining the in vitro potency of Hepatitis B surface antigen in vaccines. An inhibition ELISA has already proven to be reliable, but not in vaccine combinations. We validated this method by the evaluation of monovalent and combined vaccines from two different manufacturers. All validation parameters fulfilled the defined acceptance criteria. There was some interference with Hepatitis B potency, mainly produced by the whole cell Pertussis component, but it was not significant. A significant correlation between the Auszyme kit and the in vivo method was observed. We demonstrated that our ELISA is suitable for evaluating HB antigen in vaccines and could be considered as a potential alternative to the Auszyme kit.     

牡蛎多糖体外对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响

目的 探讨牡蛎多糖体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 采用HepG2.2.15细胞为体外细胞模型,给予不同浓度牡蛎多糖进行混合培养,作用9d后收集上清液,用ELISA法测定上清液中HBsAg、HBeAg的水平,观察药物对HepG2.2.15细胞分泌病毒杭原的影响,同时以MTT法检测药物在体外对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用.结果 牡蛎多糖浓度在0.1～1 000 μg/mL时,对细胞无明显的毒性作用;牡蛎多糖可明显抑制HBsAg、HBeAg的分泌,其半数有效浓度( IC50)分别为362.2、558.6 μg/mL,治疗指数(TI)为＞27.6和＞17.9.结论 牡蛎多糖体外具有一定的抗HBV作用.     

Efficacy of dry powders from Bacillus sphaericus: RB 80, a potent reference preparation for biological titration

Larvicidal potency of three primary powders based on Bacillus sphaericus strains 1593 and 1881 was studied on mosquito larvae. Two acetone powders, P 1593 and P 1881, were very toxic for Anopheles stephensi larvae. The potency of a third lyophilized powder RB 80 made from 1593 strain compared even better when tested against Anopheles stephensi and Culex pipiens pipiens larvae. LC₅₀'s after 48 hr were 0.15 and 0.003 mg/ml, respectively. After storage of RB 80 aqueous suspensions over 2 years or after heat exposure of RB 80 powder, larvicidal potency was still high, indicating an excellent stability. The use of RB 80, because of all its qualities, is suggested as a first experimental standard for titration of B. sphaericus preparations.     

乳酸片球菌素（Pediocin）效价测定的条件优化

目前的乳酸片球菌素（Pediocin）效价测定方法误差大、耗时较长。为了减少测定误差并缩短测定时间,研究并优化了乳酸片球菌素（Pediocin）效价测定中的几个关键因素,得到较优的实验条件：发酵液加热时间30min、菌体吸附2h、解吸附3h、指示菌加入量为400μL（30mL固体检测培养基中含菌2．1×10^8个）、试样pH为2．0时,测定的Pediocin效价误差较小;试样处理时间由12h缩短为约5h。     

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响

为了研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg免疫原性的影响,了解其佐剂功能。采用不同剂量BCG-CpG-DNA与不同剂量重组(汉逊酵母)表达的HBsAg或Al-HBsAg混合免疫小鼠,与同剂量铝佐剂疫苗对比,以放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平和抗体持续时间,ELISA法检测抗体亚类。结果显示,BCG-CpG-DNA和HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平达到或高于同剂量铝佐剂疫苗;BCG-CpG-DNA和Al-HBsAg混合,抗-HBs的中和抗体水平高于同剂量铝佐剂疫苗,并有统计学显著意义(P<0.05);添加BCG-CpG-DNA组抗体水平4周时增加不明显,到10周则显著地高于同剂量铝佐剂疫苗组,IgG2a抗体水平也高于相应的对照组。实验结果表明BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,并和AL佐剂有协同作用。     

重组CHO细胞HBsAg 纯化工艺的优化

目的：优化重组CHO细胞HBsAg纯化工艺。方法：由乙肝病毒S基因转化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养收液,经初步提纯、密度梯度离心、凝胶过滤层析可得到HBsAg纯品。结果：通过凝胶过滤层析收取HBsAg活性峰,控制HBsAg活性峰的收量,并把HBsAg活性峰的下降段再收集起来重新层析,改进后可使HBsAg的总回收率达到60％以上,而且牛血清蛋白残余量达到10mg/ml以下,HBsAg纯度97％以上。结论：重组CHO细胞HBsAg纯化工艺改进后,使HBsAg在产量及质量上均有明显提高。     

Carcinogenic potency in rodents versus genotoxic potency in E. coli: a correlation analysis for bifunctional alkylating agents

The mutagenic (M), recombinagenic (R) and SOS inducing (I) potencies of 6 bifunctional directly acting alkylating agents (mitomycin C, thiotepa, chlorambucil, nitrogen mustard, bis(2-chloroethyl)ether and bis(2-chloroethyl)nitrosourea) were measured in an E. coli test system (E. coli multitest) as the integral under the yield-dose curve obtained for each event. This potency crresponds to the cumulative yield of the affected cell population over the entire effective dose range of the chemical treatment.

A weak mutagenic activity was detected only for mitomycin C and thiotepa. Except for bis(2-chloroethyl)ether, all agents were recombinagenic and SOS inducing.

When the 3 genotoxic potencies (M, R and I) of these bifunctional alkylating agents were correlated, separately or in combination, with the respective carcinogenic potencies in rodents, a highly significant correlation was obtained with both the recombinagenic and SOS inducing potencies.     

抗HBsAg二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)基因的构建与表达

采用PCR定点突变方法,成功地构建了抗HBsAg dsFv抗体的轻、重链突变基因,NdeI和EcoRI酶切后分别插入pET20b表达质粒,经测序证明在重链第44位氨基酸和轻链第100位氨基酸已突变形成半胱氨酸(Cys).VH和VL重组质粒分别转化到大肠肝菌BL21(DE3)中,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳表明在12kD处有包含体蛋白表达,表达蛋白含量分别为28%和35%.VH和VL包含体蛋白经GuHCl变性后,等量混合在复性折叠液中结合,形成了一个约24kD并有一定活性的dsFv蛋白.抗HBsAg dsFv抗体表达及复性的成功,为今后基因工程抗体的研究及应用奠定了基础.     

乙肝阳性血浆中HBsAg的滴度与保存温度和疫苗收量关系

本文报导了乙型肝炎阳性血浆中ＨＢｓＡｇ的滴度与保存温度和疫苗收量的关系。证明：１．４─５年于─２０℃保存该血浆对ＨＢｓＡｇ滴度无明显影响;２．于─２０℃和３０℃反复冻融八次以上ＨＢｓＡｇ滴度开始下降。３．于２５℃保存５６天后,该血浆中的ＨＢｓＡｇ可下降一个滴度,提示要尽可能避免反复冻融,缩短室温保存时间。用乙肝阳性血浆制备疫苗时疫苗的收量与血浆中ＨＢｓＡｇ的滴度密切相关,当ＲＰＨＡ滴度为１：５１２时,收量明显偏低,ＲＰＨＡ滴度为１：２０４８以上时疫苗收量较高。     

HBsAg空间结构与分子进化分析

目的:获得乙型肝炎表面抗原HBsAg的生物信息学资料。方法:从Genbank中获得HBsAg的核酸序列,用ExPaSy、EBI和NCBI网站的在线软件推导其编码氨基酸序列、理化性质、空间结构,并在Blastn比对后选择不同地理株进行分子进化进行分析。结果:HBsAg由226个氨基酸组成,分子量25777．6Da,等电点8．74,为亲水性蛋白质;信号肽位于1-29aa处,二级结构由-螺旋(18．14%)、延伸(25．66%)、随机线圈(56．19%)组成。中国与日本、冈比亚、德国、西班牙、墨西哥、荷兰、瑞典、泰国的HBsAg相似率依次为99%、94%、94%、94%、91%、89%、98%、98%、98%．。用不同地理株HBsAg核酸序列构建出的分子进化树中,中国和日本的聚成一簇。结论:通过对HBsAg的生物信息学分析获得该抗原特征,为进一步研究乙型肝炎的感染与发病机制、研制基因工程疫苗以及研究HBsAg新的功能域等提供依据。