人用鼠源单克隆抗体的生产和质量控制的指南——药品专门委员会、生物工程学/药学特别工作组

<正>1.引言 免疫动物的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合结果形成杂交细胞,即杂交瘤细胞,该细胞不断生长并产生抗体。这种细胞可经克隆化后筛选,使其稳定分泌特定的专一性抗体。这些克隆细胞系的连续培养可以大量制备单克隆抗体。这种方式生产的单克隆抗体可用于各种治疗目的,如抗肿瘤治疗,免疫调节,被动免疫以及体内诊断和生物制品的制备方法。下述要求是对得自鼠源杂交瘤细胞的单克隆抗体拟在人体治疗和体内诊断应用时的要求。拟用于纯化其它制品的单抗应经本文所述方法证明为纯品不含杂质。本文不涉及用于体外诊断目的的单抗。 鼠源单克隆抗体在临床应用方面的一个重要考虑是该抗体可能与人体组织抗原(除已有描述者外)有非特异的免疫交叉反应以及可能有病毒和/或潜在致癌大分子物质。 鼠单抗用于人体治疗的基本问题可能是受者对鼠免疫球旦白或产品中的其它旦白产生抗体。这些可引起有害反应并且会限制有效抗体治疗的持续。对患者采用不能自己合成免疫球旦白链的亲代骨髓     

单克隆抗体技术在生物化学中的应用

单克隆抗体技术是近年来医学上的一项重大突破。新技术的发展明显地促进了从有机体、细胞、组织或生物液中纯化和鉴定某些分子的工作。单克隆抗体技术主要是将小鼠骨髓瘤细胞和免疫动物的脾细胞融合产生杂交瘤细胞。因为骨髓瘤细胞是一单个的恶变细胞增殖的克隆化细胞,在体外有无限增殖力。它好像多发性骨髓瘤病人产生单一个的免疫球蛋白一样,可以分泌大量化学结构均一的免疫球蛋白,但其特异性难以测知。而经抗原激活的B细胞虽然能产生针对抗原的高度特异的抗体,但它在体     

HSP70单克隆抗体的制备

利用DEAE 离子交换和ATP 亲和层析法从热休克的大鼠肝脏中分离纯化了热休克蛋白 70 (HSP70 )。用它做抗原免疫小鼠 ,通过分离脾淋巴细胞和细胞融合技术 ,得到了杂交瘤细胞 ;用酶联免疫吸附测定法筛选出了阳性克隆 ;经过多次亚克隆、抗体的大量制备及分离纯化 ,得到了抗HSP70的单克隆抗体。用此一抗和Western免疫印迹技术分析了C6 大鼠神经胶质瘤细胞中HSP70的表达。     

小分子抗体的研制

纯化的、具有特异性的单克隆抗体在生物技术及医学上有广泛应用,但可能不久会被小分子抗体取代。1975年发明单克隆抗体技术的剑桥分子生物学实验室研究人员在Nature 杂志上发表了他们的该项实验成果,医学研究协会已经为该项技术申请了专利。文章的作者之一Griffiths说,如果该项技术广泛应用,可能在三天左右就能得到结合特定抗原的分子,这是一种潜力很大、非常有效的实验发明。另一作者认为该项技术有望节省     

基于单个B细胞抗体基因扩增技术筛选马IgG1单克隆抗体*

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选。首先,将马IgG蛋白(EqIgG1-C)密码子优化后合成到真核表达载体pcDNA3.4上,纯化出抗原蛋白。随后,使用蛋白质免疫小鼠,分离脾细胞后利用流式细胞术分离特异性单个B细胞,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,用overlapping PCR方法扩增出线性化的完整抗体,并进行鉴定。结果从80个B细胞中获得了27株特异性重组单克隆抗体,并挑选出3株线性结合活性最强的抗体基因构建到表达载体上,共转染Expi293F^TM细胞后表达纯化,经过ELISA和Western blot验证,显示获得的抗体可以和EqIgG1-C蛋白有良好的结合作用。使用该方法可以省时高效的获得特异性抗体,为马的免疫学研究提供了重要研究工具,为鼠单克隆抗体筛选提供了技术拓展。     

萤火虫荧光素酶单克隆抗体的制备与抗原决定簇的研究

以大肠杆菌表达的萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase)为抗原 ,免疫小鼠并进一步筛选与克隆 ,共得到 6株单克隆抗体 .制备腹水并纯化获得抗体后 ,对这 6株抗体与天然态和热变性态蛋白质以及蛋白酶解片段的结合性质进行了鉴定 .认为这 6株抗体的抗原决定簇都是顺序决定簇 .发现其中有 2株单抗与热变性态蛋白质及酶解片段的结合能力较强 ,而不与天然态蛋白质结合 ,其抗原决定簇可能是位于蛋白质内部的肽段 .另外 4株抗体既可与热变性态蛋白质以及酶解片段结合 ,也可与天然态蛋白质结合 ,其抗原决定簇可能位于蛋白质分子表面 .     

克隆选择的动力学模型

本文建立了抗原对于抗体生成的克隆选择的一个动力学模型。一种抗原虽然可能同多种抗体结合,并通过同装配在淋巴细胞膜上的抗体(即细胞表面受体)的结合促进它们的克隆,但是由于选择作用,只有一种抗体以及产生它的细胞可以同这种抗原的特定的抗原决定簇达到稳定的定态或稳定的周期状态。在我们的模型中,究竟选出哪一种抗体取决于抗体同抗原的结合常数,抗原同受体结合后促进细胞增殖的能力,以及细胞的寿命。     

人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗人突触小体相关蛋白25(SNAP25)的鼠源单克隆抗体。方法:利用大肠杆菌表达SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,筛选针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,鉴定抗体亚型;用杂交瘤细胞株制备腹水单抗,纯化后利用SDS-PAGE检测抗体纯度。结果:表达并纯化得到纯度大于90%的SNAP25蛋白,免疫小鼠后经2轮筛选得到12株阳性杂交瘤细胞株,其中抗体重链包括IgG1、IgG2型,轻链大部分为κ链;选择具有相对较高抗原结合活性的14号杂交瘤细胞株制备腹水,纯化后得到纯度大于90%的抗体。结论:获得1株高纯度的针对SNAP25的鼠源单克隆抗体,为肉毒毒素的检测奠定了基础。     

单克隆抗体在医学上的应用

<正>1975年khler和Milstein用体细胞杂交首先生产了单克隆抗体。从那以后,证明杂交瘤技术对分析生物学和分析医学基础研究以及应用方面的复杂问题迈进了一大步。 单克隆抗体是由一个细胞克隆产生,其成分(类,亚类,型和结合P位等)是同源的,只针对复杂抗原的一个抗原决定簇,并有相同的亲和性,抗体滴度也很高。反之,免     

CD59天然抗原的制备及纯化

目的 构建人matureCD59-mFC—pBOS真核表达载体,转染COSa细胞进行瞬时表达,对表达产物进行鉴定及纯化。方法在人Jurkat细胞中提取细胞总RNA,运用RT—PCR方法扩增matureCD59基因,定向克隆入带有mFC标签的真核表达载体pBOS中,大提质粒后通过电转仪转染COSa细胞,ELISA及特异抗体检测CD59的表达,并大量收集细胞上清用ProteinA进行纯化。结果构建r重组载体matureCD59．mFC—pBOS,瞬时转染COSa细胞,初步纯化得到天然表达的CD59抗原。结论带有mFC标签的CD59天然抗原的得到为制备抗人CD59单克隆抗体开辟了一条新的途径。     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体的产生及鉴定

为了定量测定炭疽保护性抗原及阐明其免疫机制,我们开展了细胞杂交瘤技术的工作。于1982年初获得4株能产生抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体的细胞株。传代8个多月后冰冻保存。最近从第20代冰冻保存的细胞复苏,又传30多代,仍能持续稳定地分泌特异性抗体。 用亲和层析纯化的炭疽保护性抗原免疫了     

抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究

以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断。这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内。Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合。这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体。这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具。     

双抗原特异的单克隆抗体

美国Quest Biotechnology公司1990年10月公布其生产血栓溶解剂的子公司Polycell公司非独占性地向日本制药企业提供??技术,并得到了许可资料.在日本,双抗原特异的单克隆抗体已接近实用化. 双抗原特异抗体是结合2种抗原的抗体.通常是由结合相同抗原的2个蛋白链构成抗体.Polycell公司开发了能分泌2种不同抗原的单克隆抗体的杂交瘤,制造??这就是双抗原特异抗体的技术.在这次批准的血栓溶解剂是使用能结合构成血栓的血纤维蛋     

基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术

肿瘤细胞表面抗原的表达量低,免疫原性弱,因抗原构象改变的原因,用传统的固定化抗原方法很难获得有价值的噬菌体抗体。这类抗原大多具有复杂的结构,且其转运、定位与细胞类型及所处的微环境有关。在基于细胞的筛选中,靶抗原以天然状态存在,不需纯化,甚至可以对未知抗原进行筛选,因此广泛用于对内化抗体和血管内皮抗原表位抗体的筛选。基于细胞的抗体筛选中的主要问题是因非特异结合造成的选择背景过高,迄今,已有许多旨在改善选择灵敏度和特异性的研究开展起来。随高通量流式细胞术、组合化学及蛋白质组学研究技术在细胞筛选中的运用,必将使其日趋实用和成熟。我们拟以细胞和组织筛选的技术做一概括,为了解基于细胞的筛选和优化设计提供参考。     

提高抗原特异性杂交瘤生成率

<正>用脾细胞与骨髓瘤细胞杂交的技术以产生单克隆抗体,已经广泛地引起了学者们的兴趣。这项技术的主要缺点之一就是由于抗原特异性的杂交瘤细胞产生率很低,因此必须用大量的细胞进行融合,维持和筛选其是否产生抗体。这种令人失望的比率已经限制了杂交瘤技术的应用,并给杂交瘤的进一步发展带来了困难。作者们这里发表的两种技术,可在细胞融合后大大提高杂交瘤产量。     

双特异抗体定向运载抗原作为一种新型佐剂系统的研究进展

目前采用基因重组等生物技术制备了大量的纯化亚单位疫苗或合成疫苗,这些疫苗的免疫原性很弱,需要佐剂的帮助才能有效地引发抗体应答。传统的佐剂具有很多本身无法克服的缺陷,促使人们研究开发新的佐剂系统。本文对双特异抗体的概念、Ｔ细胞在免疫应答中的作用及抗原的定向运送、双特异抗体介导的抗原定向运送及佐剂效应等方面对双特异抗体定向运送抗原作为一个新的佐剂系统给予了较为详细的阐述     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

抗牛生长激素单克隆抗体及其免疫亲和吸附柱的制备

我们用杂交瘤技术获得了分秘抗牛生长激素单克隆抗体的细胞系(4B-2)。接种此细胞于小鼠所产生腹水的抗体含量达10mg／ml。经免疫亲和层析方法纯化的单克隆抗体,属1BG1型。将单克隆抗体偶联到Sepharose 4B上,创成了免疫亲和吸附柱,可以从牛垂体匀浆中一步纯化牛生长激素。偶联有50mg单克隆抗体的亲和柱一次可结合3mg牛生长激素。经单克隆抗体亲和层析纯化的牛生长激豢,保持了与兔肝细胞膜受体结合的能力,及在去垂体大白鼠中促进胫骨生长板生长的功能。     

抗GPC3 C端抗体辅助杀伤肝癌细胞HepG2的活性检测及抗原表位鉴定

目的：检测制备的7株抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）蛋白C端单克隆抗体是否具有辅助杀伤肝癌细胞的活性,并研究其识别的抗原表位。方法：用细胞增殖法检测制备的抗体是否具有抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性;用生物信息软件分析GPC3蛋白C端（359～580残基）的结构及抗原特征,并据此将其分为4个截短片段,将克隆的各基因片段分别连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,进行蛋白表达和纯化,用间接ELISA和Western印迹分析GPC3C端单克隆抗体的表位识别情况。结果与结论：制备的7株单克隆抗体对肝癌细胞HepG2均具有不同程度的辅助杀伤作用,其中5号单克隆抗体的辅助杀伤效果最好;表达并纯化了GPC3C端4个截短片段的重组蛋白;间接ELISA和Western印迹检测结果表明,7株抗体均特异性结合GPC3蛋白的473～525残基区段。     

抗人OX40单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:获得全人源抗人OX40特异性抗体候选株,为相关药物开发奠定基础。方法:依托本实验室构建的大容量全合成全人源噬菌体单链抗体库平台,以OX40为抗原进行固相筛选,经过3轮条件渐进严苛的筛选后,阳性克隆得到富集;将其中富集效果最好的一株单链抗体scFv-1改造成全抗体(Ig G1)形式,改造成功的重组质粒按照一定比例转染HEK293-F细胞进行抗体的瞬时表达;基于AKTA系统对全抗体进行纯化,将纯化得到的全抗体重命名为OX40mab-1。通过ELISA、间接免疫荧光、流式细胞术等试验分别验证OX40mab-1与抗原的结合活性、特异性、血清稳定性;通过BIAcore 3000初步测定抗体亲和力。结果:3轮筛选后得到1株富集率达95%的单链抗体,改造成全抗体形式后,与抗原OX40的结合EC50为0.015μmol/L;该抗体与其他无关抗原均不结合,特异性良好;37℃血清放置15 d后,与抗原依具有较好的结合活性,血清稳定性良好;经BIAcore 3000初步测定该抗体亲和力为251 nmol/L。结论:获得1株理化性质良好、特异性较好的抗OX40全人源单克隆抗体OX40mab-1,具有继续开发价值。