北京油鸡ADSL基因的克隆、表达及其结构与功能分析

采用RT-PCR与RACE方法扩增出北京油鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)基因全长cDNA序列,亚克隆和序列分析结果表明:该基因开放阅读框长为1455个碱基,编码485个氨基酸;5'端非转录调控区具有典型管家基因的特征,在临近起始密码子27号碱基发生C→T突变,该突变使得本来小是核呼吸因子2(NRF-2)结合位点的CTCC突变为NRF-2结合位点CTTC.将ADSL基因完整斤放阅读框重组至融合表达载体pGEX-4T-l中,构建成北京油鸡ADSL基因融合表达载体pOEX-ADSL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白在约80.5kD处有特异蛋白条带出现,与预期分子量大小一致,等电点为6.79.该蛋白的表达最随诱导时间的延长而增加,5h达最高值,达到细胞总蛋白的26.9%,且主要以不可溶的包涵体形式存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后Western blotting检测表明其为北京油鸡ADSL蛋白,为其进一步的生物学功能及其应用研究鉴定基础.     

人NFBD1启动子的鉴定与初步分析

NFBD1,也称MDC1,是一个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为了进一步深入研究其转录调控机制,本研究克隆鉴定了NFBD1的启动子.首先应用5′ RACE技术鉴定了NFBD1的转录起始位点,首次发现NFBD1至少存在3种丰度和转录起始位点不同的转录变异体.然后,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了覆盖NFBD1基因5′侧翼区起始密码子ATG上游5 kb区域的一系列NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,NFBD1启动子区域定位于主要转录起始位点区域附近1.5 kb的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,NFBD1启动子缺乏TATA盒,但含有典型的CCAAT盒和GC盒以及其它潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和NF-Y等转录因子可能参与NFBD1的转录调控     

鸡基因组差异表达基因翻译起始密码子上下游序列的比较研究

翻译起始调控是基因表达调控的一个关键步骤之一。本文以鸡为研究材料,比较研究了鸡基因组高表达基因和低表达基因翻译起始密码子上下游的碱基序列差异,旨在寻找影响鸡基因表达水平的特异性调控位点。全部3 020个单剪接基因完整的mRNA序列及有详细注释的5＇UTRs序列从Ensembl下载。编写计算机程序,读取每个基因mRNA起始密码子上下游各位点的碱基。研究发现,起始密码子上游-3、-2位点可能是鸡基因组基因表达起始密码子正确识别的关键位点。起始密码子上下游的碱基组成分析发现,高表达基因和低表达基因起始密码子的上游均倾向使用（G＋C）,高表达基因的使用偏倚尤为强烈。序列差异比较发现,高表达基因在-9、-6、-3、＋4位点显著偏向G,在-1、-2、-4、-5位点显著偏向C。低表达基因起始密码子上游使用A、U的频率显著高于低表达基因。在-19位点强烈偏向A,在＋1、＋11、＋14位点强烈偏向U。     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

Ex-FABP 作为鸡腹脂性状主要候选基因的研究

细胞外脂肪酸结合蛋白 (extracellular fatty acid-binding protein, Ex-FABP) 基因是脂肪酸结合蛋白 (fatty acid-binding protein, FABP) 家族的另一成员,参与鸡的脂肪酸、肌纤维、骨骼等调控过程 . 利用 PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism) 和 DNA 测序的方法,对不同品种的杂交鸡进行了 Ex-FABP 基因 5′调控区部分序列的多态性分析,发现了 3 个单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) 位点 . 其中,此片段中的碱基 C (－1000) 的插入和碱基 T → C (－1011) 的突变,导致此处比野生型基因少了 1 个 cap ,多了 1 个 Nkx-2 、 1 个 AhR/Ar 和 2 个 CF1 等转录因子结合位点的产生 . 利用 SAS 软件对 Ex-FABP 基因 5′调控区的 SNPs 与屠体性状的最小二乘分析,发现基因型 BB (突变型) 与腹脂重存在极显著相关 (P<0.01). 研究结果表明,细胞外脂肪酸结合蛋白 (Ex-FABP) 基因是影响脂肪沉积、控制腹脂性状的主要候选基因 .     

鸡MC4R基因的SNPs及其与屠体性状的相关研究

黑素皮质素受体(MC4R, melanocortin-4 receptor)基因的突变与猪、鼠和人等的食欲、肥胖、生长等性状有关, 而鸡MC4R基因的功能却知之甚少. 利用PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)和DNA测序的方法, 对资源家系F₂代鸡群MC4R基因多态性进行了分析, 发现存在4个单核苷酸多态(SNPs, single nucleotide polymorphisms)位点. 其中, 在MC4R基因5′调控区-524 nt发生了碱基的转换突变(C→T), 导致突变型基因比野生型基因多了一个NF-E2和一个cap转录因子结合位点; 在MC4R编码区(61 nt)发生了碱基的错义突变(G→A), 导致此处蛋白质的氨基酸由甘氨酸变为精氨酸; 在MC4R编码区315和336 nt发生了碱基的颠换突变(G→T)和转换突变(C→T), 这两个突变为同义突变. 通过最小二乘分析SNPs与屠体性状的关系, 结果是突变的BB, DD和FF等基因型与鸡的体重、全净膛重(或半净膛重)、腿肉重等存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的关系, 但与腹脂重不显著. 结果表明, MC4R基因可以作为影响和控制鸡体重、生长等屠体性状的主要候选基因.     

核呼吸因子的研究进展

核呼吸因子（nuclear respiratory factors,NRFs）包括NRF-1和NRF-2,属于转录激活因子,在调控核基因编码和线粒体基因编码的呼吸链亚基表达中发挥着直接或间接的作用。除此之外,核呼吸因子还具有调控线粒体运输蛋白基因表达和神经元相关因子合成的作用。就NRF-1和NRF-2的分子生物学结构、生物学功能和调控等三个方面进行综述。     

人ACER2基因启动子的鉴定与初步分析

碱性神经酰胺酶2(alkaline ceramidase 2,ACER2)是一个参与脂质类信号分子神经酰胺代谢的酶分子,在细胞增殖、衰老和凋亡等过程中起重要作用。为了进一步研究ACER2基因的转录调控机制,该研究克隆鉴定了ACER2基因的启动子。首先,应用5'RACE(rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增)技术鉴定了ACER2基因的转录起始位点。然后,通过PCR定向克隆和定点突变策略,构建了三个长度不同的覆盖ACER2基因5'端侧翼区起始密码子ATG上游约1.3Kb区域的一系列ACER2基因启动子荧光素酶报告基因重组体。启动子活性分析表明ACER2基因启动子定位于转录起始位点附近约670 bp的区域内。转录因子结合位点分析结果表明,ZCER2基因启动子含有Sp1、GATA-1和AP-1等潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和GATA-1等转录因子可能参与ACER2基因的转录调控。     

鸡生长激素基因5′端部分调控区的克隆分析

利用PCR技术扩增、克隆、测序了7个跨越不同生长速度的鸡品种(系)的生长激素(GH)基因的5′端部分调控区。这7个品种(系)分别为:高生长速度的宝罗肉鸡父本;较高生长速度和一定的产蛋性能的宝罗肉鸡母本;肉蛋兼用型的芦花鸡;中等生长速度和中等体重的蛋鸡品种洛岛红和农大褐;生长速度较慢体重较轻的蛋鸡品种北京白鸡和生长速度很慢但又不是矮小型的地方品种丝毛乌骨鸡。所扩增的片段长度为760bp,包括了转录起始位点5′端侧翼区的473bp、两个可能的TATA框、组织特异性转录因子结合位点、第一个外显子和部分第一内含子。所有克隆的鸡GH基因5′端调控区与Tanaka发表的序列相比,均在-34碱基的位置上缺失一个胞嘧啶C,在 160与 161碱基之间多1个胸腺嘧啶丁,在 175碱基的位置上出现了以腺嘌呤A替换了鸟嘌呤G的情况。7个品种(系)之间的比较显示,鸡GH基因启动区具有极高的保守性,在具有不同生长速度的鸡品种间不存在任何差异。说明鸡的不同生长速度和成年体重,不是由于生长激素5′调控区变异造成的。鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或3′端侧翼序列的影响。     

鸡Myostatin基因单核苷酸多态性的群体遗传学分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR－SSCP和测序的方法发现了5个位于Myostatin基因5′－和3′－调控区的单核苷酸多态性位点,对北京油鸡、白耳鸡、石歧杂、矮小黄鸡、小型黄鸡、惠阳胡须鸡、隐性白羽鸡、海兰、AA鸡等不同鸡种的该单核苷酸多态性分析结果表明：Myostatin基因的5′调控区引物P60／P61扩增片段多态性是由3个核苷酸的改变而产生的[分别是G→A（304位）、A→G（322位）、G→（344位）],引物P93／P94扩增片段的多态性是由G→A（167位）突变造成的,引物P117。P118PC扩增片段多态性是由T→C（177位）造成的。3′调控我引物P80／P81扩增片段多态性是由第7263位A突变为T造成的,引物P76／P77扩增片段多态性是由A→G（6935位）造成的。不同鸡种群体遗传学分析表明,5′－调控区引物60／P61扩增片段多态性片段多态性是由A→G（6935位）造成的。不同鸡种群体遗传学分析表明,5′－调控区引物P60／P61扩增片段多态性位点在北京油鸡的基因型频率分布与其他的品种有很大的差异,其BB型频率为0．700,AA基因型频率仅为0．033,而其他鸡种中以A基因优势;对于引物P93／P94,品种间的基因型频率差异极显著（P＜0．01）,北京油鸡和AA鸡的EE型频率鸡种中以A基因占优势;对于引物P93／P94,品种间的基因型频率差异极显著（P＜0．01）,北京油鸡和AA鸡的EE型频率低于其他品种,白耳鸡和海兰蛋鸡以EE型为主,其频率高于其他品种;3′－调控区引物P80／P81多态怀位点在9个鸡种中都是等位基因C占优势。引物P76／P77,总体上MM型的频率较低,杂合子MN型的频率较高。     

蒲洼生态系统的规划与分析

蒲洼生态系统的规划与分析徐明（北京市气象局农气中心,１０００８１）ＰｒｏｇｒａｍｍｉｎｇａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰｕｗａＥｃｏｓｙｓｔｅｎ．￥ＸｕＭｉｎｇ（ＢｅｉｊｉｎｇＭｅｔｅｏｒｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｒｅａｕ,１０００８１）...     

Analysis of purines

The fact that purine nucleotides and nucleosides are so important in normal cellular functions makes their analysis complicated. In order to measure tissue levels, samples have to be very rapidly fixed. Measurement in blood is complicated by the risk of releasing purine nucleotides during the sampling procedure and by the possibility of very rapid inactivation by cellular mechanisms as well as extracellular enzymes. Dialysis probes may offer a possibility of sampling extracellular fluid, but the trauma of placing the dialysis fibre can in itself provide a major stimulus for purine release. Once an adequate sample is taken, there are several methods for the actual quantitation, but most commonly various HLPC procedures are used.     

谱分析在DNA序列分析中的应用

目的：谱分析是信号处理的常用方法,其中的统计相关分析、傅里叶变换、小波变换和数字滤波等手段已逐渐应用到DNA序列的分析中,这些应用包括DNA序列的周期性分析、基因识别和同源性分析等方面。本文对谱分析方法在DNA序列分析中的应用情况进行简单的综述。     

Phylogenetic Analysis of Burkholderia Species by Multilocus Sequence Analysis

Burkholderia comprises more than 60 species of environmental, clinical, and agro-biotechnological relevance. Previous phylogenetic analyses of 16S rRNA, recA, gyrB, rpoB, and acdS gene sequences as well as genome sequence comparisons of different Burkholderia species have revealed two major species clusters. In this study, we undertook a multilocus sequence analysis of 77 type and reference strains of Burkholderia using atpD, gltB, lepA, and recA genes in combination with the 16S rRNA gene sequence and employed maximum likelihood and neighbor-joining criteria to test this further. The phylogenetic analysis revealed, with high supporting values, distinct lineages within the genus Burkholderia. The two large groups were named A and B, whereas the B. rhizoxinica/B. endofungorum, and B. andropogonis groups consisted of two and one species, respectively. The group A encompasses several plant-associated and saprophytic bacterial species. The group B comprises the B. cepacia complex (opportunistic human pathogens), the B. pseudomallei subgroup, which includes both human and animal pathogens, and an assemblage of plant pathogenic species. The distinct lineages present in Burkholderia suggest that each group might represent a different genus. However, it will be necessary to analyze the full set of Burkholderia species and explore whether enough phenotypic features exist among the different clusters to propose that these groups should be considered separate genera.