菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物全基因组序列测定

以感病组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并测定黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)辽宁分离物(CGMMV-LN)的基因组全序列。CGMMV-LN基因组全长6 422 nt,5'非编码区(noncoding region,NCR)和3'NCR分别为59 nt和175 nt。CGMMV-LN编码的4个蛋白依次是186 kD和129kD的复制酶,29 kD的移动蛋白和17.4 kD的外壳蛋白。CGMMV-LN与其他4个CGMMV分离物基因组核苷酸序列同源性为97.6%～99.3%,与同属其他3种病毒基因组核苷酸序列同源性仅为61.7%～62.8%。基于186kD复制酶和外壳蛋白氨基酸序列的同源树显示:侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒可分为2个亚组,亚组I包括所有CGMMV分离物,亚组II包括Kyuri绿斑驳花叶病毒(Kyuri green mottle mosaic virus,KGMMV)、黄瓜果实斑驳花叶病毒(Cucumber fruit mottle mosaic virus,CFMMV)和小西葫芦绿斑驳花叶病毒(Zucchini ...     

蚕豆萎蔫病毒2号山西分离株的全基因组序列测定与分析

本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）对感病青椒（Capsicum annuum）进行了分子鉴定. 序列测定及分析发现,侵染青椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2, BBWV2）. 为明确BBWV2青椒分离物（BBWV2 Ca）的分类地位,对BBWV2 Ca的全基因组序列进行了分段克隆、序列测定和分析. BBWV2-Ca RNA1全长5 929 bp,含有1个ORF. BBWV2 Ca RNA2全长3 559 bp,含有1个ORF,编码3种蛋白：VP53/VP37、外壳蛋白大亚基（large coat protein, LCP）和外壳蛋白小亚基(small coat protein, SCP). 全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在77.9%～93.7%之间|RNA2与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在80.2%～93.8%之间. 全序列系统进化分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2-XJ14-3以及BBWV2-RP3株系聚为一簇,亲缘关系最近|RNA2与BBWV2-Am形成一个独立分支,亲缘关系最近.     

豇豆病毒病病原的分子鉴定

为澄清浙江省豇豆病毒病病原及其分类,采用马铃薯Y病毒属通用引物Sprimer扩增了浙江豇豆线状病毒基因组3′－末端序列。同时又根据已知CMV RNA3序列设计引物pCMV-44-63/1200-1181,扩增了混合的CMV－ZJ运动蛋白基因全序列。外壳蛋白氨基酸序列分析表明,产中仅存在一种线状病毒（CV－ZJ）,该病毒与一泰国豇豆蚜传花叶病毒（CABMV）具有最高的同源性（98.6%）,与花生条纹病毒（PStV）、石斛花叶病毒（DeMV0．）、赤豆花叶病毒（AZMV）、黑眼豆豆花叶病毒（BICMV）和菜豆普通花叶病毒（BCMV）分离物间的同源性为88.5%－94.4%,而与其它CABMV分离物的同源性均低于70％。进化树分析表明,PStV、AZMV、DeMV、BlCMV和BCMV为同种异名,应统称为BCMV,而CABMV为另一种病毒;CV－ZJ和泰国CABMV分离物应分类为BCMV豇豆株系。CMV－ZJ的运动蛋白序列分析表明,该分离物属于CMV亚组Ⅰ,与其它分离物氨基酸序列同源性为93.1%－97.8%。     

两株大蒜病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用建立cDNA库的方法 ,通过RT PCR分别扩增和克隆了感染我国天津地区大蒜的大蒜花叶病毒 (GMVc)和大蒜潜隐病毒 (GLVc)的外壳蛋白 (CP)基因 ,并对其分别在原核细胞中进行了诱导表达和表达产物的分析。克隆基因的序列测定与分析表明 ,GMVc的CP基因全长 867个核苷酸 ,编码 2 89个氨基酸 ,与报道的一株GMV的核苷酸和氨基酸的同源性分别为 88.5%和 97.2 % ,属于马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)的成员 ;GLVc的CP基因全长 885个核苷酸 ,编码 2.94个氨基酸 ,与报道的一株GLV的核苷酸和氨基酸同源率分别为 73.6%和 90.9% ,属于香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus)的成员 ;克隆基因的表达产物经SDS PAGE分析表明 ,GM Vc和GLVc的外壳蛋白分别约 32kD和 34kD ,与预测的结果一致。本实验结果对感染我国大蒜的病毒进行分子水平的确切诊断、分类和调查奠定了基础 ,将对大蒜病毒病的防治与脱毒大蒜的生产具有重要的意义。     

甘蔗花叶病毒3’末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV-CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaI位点上,筛选得到多个重组质粒。选取其中一个克隆SCMV-CA54进行测序,得到一个全长为1296 bp的核苷酸序列。这段序列由一个长为1044 bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279 bp的3’末端非编码区序列（3'-UTR）及poly(A)尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白b（NIb）基因序列。将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离物CP核苷酸序列的同源性介于63.7%～77.6%之间,氨基酸的同源性介于64%～89%之间。根据马铃薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV-CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系划分标准之间。这是我国首次报道SCMVCP基因序列。     

蚕豆萎蔫病毒2号板蓝根分离株全基因组序列测定与分析

板蓝根(Isatidis Radix)病毒病害的发生已对其产量和品质造成了严重影响。因此,建立一套灵敏、快速、有效的板蓝根病毒病害检测手段十分重要。本研究利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)等技术对感病板蓝根进行鉴定,确定其被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2, BBWV2)所侵染。为明确BBWV2板蓝根分离物(BBWV2-IR)的进化关系,对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其RNA1序列全长为5 955 bp,RNA2序列全长为3 602 bp,分别编码由1 870和1 064个氨基酸组成的多聚蛋白质。序列比对发现,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am分离物的同源性最高,RNA2与BBWV2-SN分离物的同源性最高。全基因组变异情况分析表明,BBWV2-IR RNA1和RNA2分别与其同源性最高的株系存在多个氨基酸变异位点。系统进化分析表明,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am RNA1聚为一簇,RNA2与BBWV2-SN RNA2聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了BBWV2板蓝根分离株的全基因组序列,并明确其在进化过程中的地位和区域变化情况,为进一步研究BBWV2-IR致病性变异提供一定的理论基础。     

T4病毒研究进展

T4病毒科由一类单股正链RNA病毒组成,分为松天蛾β样病毒属和松天蛾ω样病毒属。这2个属的病毒具有不同的基因组结构,β样病毒含单组分基因组,其结构蛋白由一亚基因组RNA表达; 而ω样病毒含双组分基因组,2个RNA分子分别编码复制酶蛋白和结构蛋白。在T4病毒基因组RNA 3′端有类似tRNA的二级结构。ω样病毒壳蛋白的氨基酸序列一致性高达66%～86%, 而β样病毒壳蛋白的氨基酸同源性则要低得多。在昆虫细胞中表达壳蛋白基因时都能形成病毒类似粒子。该文还介绍了T4病毒复制机理以及T4病毒与其他病毒的进化关系。     

狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析

对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMVCA)株系进行克隆和序列分析。CMVCARNA1全长3356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa的1a蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP)。序列同源性比较表明,CMVCARNA1、2、3与CMV亚组IACMVFny、亚组IBCMVSD、亚组IICMVQ株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanutstuntvirus,PSV)RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%。上述研究未发现CMVCA基因组与PSVRNA链的重组,CMVCA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA35′NTR结构分析以及RNA35′NTR和CP系统进化树分析表明,CMVCA属CMVIB亚组。     

3种菊花病毒/类病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的构建与准确性评价

菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量。为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg²⁺浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40。敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0×¹⁰3拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×¹⁰3拷贝/mL~1.0×¹⁰10拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×¹⁰4拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV%)为4.81%,重复性好。在南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5×¹⁰4拷贝/mL~5.5×¹⁰7拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd 3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法。     

不同品种菊花和贵州产野菊花中木犀草素的含量比较

目的测定并比较不同品种菊花和贵州产野菊花中木犀草素的含量。方法用高效液相色谱法测定木犀草素的含量。色谱柱为ODS柱（4．6mm×250mm,5μm）,流动相为甲醇-水-冰醋酸（体积比45：55：0．4）,检测波长为254nm,流速1．0mL／min。结果7个菊花样品的木犀草素含量,以贵州野菊花的木犀草素含量最高（3．876mg／g）,杭菊的木犀草素含量最低（0．302mg／g）。结论贵州产野菊花中木犀草素的含量均高于其他品种菊花,具有较高的药用价值。     

山羊关节炎脑炎病毒甘肃株全基因组克隆和序列分析

根据GenBank中发表的山羊关节炎脑炎病毒CAEV-CO株（caprine arthritis encephalitis virus-CO,CAEV-CO）的全基因组序列（序列号：NC-001463）,设计合成了7对引物,对CAEV甘肃株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果表明,CAEV-甘肃株基因组全长为9186nt。与国际标准毒株CAEV—CO株相比,在编码区有12个碱基的缺失,二者的核苷酸同源性为91．0％;在非编码区有27个核苷酸的插人,核苷酸同源性为97．0％。gag、pol、蛋白Q、tat、env基因编码的氨基酸同源性分别为94．6％、94．7％、87．9％、94．7％和91．5％。     

四种菊花超临界CO_2萃取物的GC-MS分析

对4种菊花:野菊花、神农香菊、杭黄菊和黄金菊进行超临界CO2萃取(SFE),运用GC-MS检测超临界萃取物中的化学成分,并比较4种菊花类药材萃取物化学成分的差异。结果表明:4种菊花SFE萃取物中共检测到77种成分,主要为萜烯类、醇、醛、酮和脂肪烃类成分,其中仅有14种成分为2种或以上菊花萃取物所共有,不同品种菊花之间所含成分具有明显的差异。     

Genetic diversity and methylation polymorphism analysis of Chrysanthemum nankingense

The diploid species Chrysanthemum nankingense (Anthemideae, Asteraceae) is closely related to the commercially important hexaploid ornamental species Chrysanthemum morifolium and is well adapted to poor environments. In this study, phenotypic variants of C. nankingense were first identified by morphological traits. Using EST-SSR (simple sequence repeat) analysis, we detected some absent EST-SSRs. The percentage of AFLP (amplified fragment length polymorphism) polymorphic fragments was 78.2%, indicating high genetic diversity. To evaluate the genome methylation level and methylation polymorphism, we used the MSAP (methylation-sensitive amplification polymorphism) technique to analyze the 30 C. nankingense lines. The total DNA methylation level ranged from 54.6% to 62.6%. Most of the MSAP-methylated fragments (97%) were polymorphic in the lines. The U-values associated with hemi-methylation were larger than those associated with full methylation in four of the 30 lines, and six individual values were statistically significant (U > 1.96). The high genomic diversity as well as the high methylation polymorphism may be responsible for the morphological polymorphism. There was no significant correlation between the phenotypic and genetic diversity among the lines.     

口蹄疫病毒泛亚型O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡。以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒。