产气气杆菌茁霉多糖酶的研究I．酶的提纯和性质

产气气杆菌(Aerobacter aerogenes) 10016的茁霉多糖酶(pullulanase E．C．3．2．1．41)用Sephadex G100凝胶过滤、聚丙烯酰胺垂直板型凝胶电泳进行纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的纯酶。纯酶作用的最适温度为50℃,最适pH为5．3—5．8,耐热性较差,50℃ 4小时后仅存活力10％。纯酶在pH4．3一8．6稳定。酶作用于糯米淀粉的米氏常数Km为2.0×10-2克／毫升。用聚丙烯酰胺薄屡凝胶等电聚焦测定酶的等电点pI为3．8,用SDS凝胶电泳测定酶的分子量为51,000—52,000;此酶是一种糖蛋白;含糖总量为6．5—7．0％;纯酶能专一性的水解茁霉多糖、糯米淀粉,也能分解糊精,而不作用于糖原、纤维二糖以及环状糊精。     

垂直板型凝胶制备电泳及其在分离红曲霉葡萄糖淀粉酶中的应用

红曲霉葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,EC3.2.1.3)可用于由淀粉生产葡萄糖。为了解决生产中的一些问题,有必要对酶的作用原理进行较深入的研究。但是,红曲霉葡萄糖淀粉酶具有多形性,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为     

大肠杆菌青霉素酰化酶的提纯及其性质的研究

大肠杆菌(Escherichia coli) AS 1.70发酵液经有机溶剂处理,硫酸铵分级,再用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到了聚丙烯酰胺凝肢电泳均一的青霉素酰化酶纯品。纯酶作用的最适温度为45—55℃,最适pH为7．0—7．7,在无NIPAB存在下,纯酶在45℃以下稳定,但在55℃保温一小时,酶活力残存33．58％,纯酶在pH5．0—8.0稳定。酶作用于重排酸的米氏常数为3．33×10-2g／ml。Ag+对酶有抑制作用。用聚丙烯酰胺薄层凝胶等电聚焦测定酶的等电点(pI)为6．7—6．8,用SDS凝胶电泳测酶的亚基分子量分别为14300和58900。纯酶具有水解苯甘氨酸甲酯盐酸盐的作用,反应两小时产生12．74mM苯甘氨酸。     

蝮蛇Agkistrodon halys Pallas蛇毒纤溶酶对纤维蛋白质的作用

应用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法证明蝮蛇毒纤溶酶对人体纤维蛋白原的α(A)链和β(B)链都有作用。借助酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察到人纤维蛋白原经蝮蛇毒纤溶酶水解后,产生一系列分子量大小不等的碎片X′、Y′、D′和E′。     

用亲和层析法分离提纯红曲霉葡萄糖淀粉酶的不同分子型

葡萄糖淀粉酶(产生菌为红曲霉(Monascus rubiginosus Sato)AS3.3491)是多型性酶,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈三条区带,相应于AS3.2199(原使用菌株)所产生的E_3、E_4和E_5。由于这三个组分性质极为接近,提纯十分困难。我们曾用DEAE一纤维素柱层析和垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法分离得到了凝胶电泳     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节——Ⅴ.拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rafai)N_2-78洗涤菌丝体纤维素酶诱导形成过程中核酸代谢的变化

拟康氏木霉N_2-78洗涤菌丝体在槐糖诱导下合成纤维素酶(C_1酶、C_x酶和β-葡萄糖苷酶)的同时,RNA含量也发生有规律的变化。采用加核酸酶抑制剂和低温、快速抽提的方法,从槐糖诱导的N_2~-78洗涤菌丝体中提取总RNA,经寡聚(dT)—纤维素柱分离,得到含 Poly(A)的RNA。聚丙烯酰胺凝胶电泳和亲合层析分离证明,经槐糖诱导后,菌丝体中Poly(A)-RNA含量增加。     

康氏木霉C1酶的简捷提纯法及酶性质的研究

康氏木霉(Trichoderma Koningii)白色变异菌株AS 3．4001的粗酶制剂,经Sephadcx G-75凝胶过滤柱脱盐并除去大量杂蛋白,然后通过DEAE—scphadcx A一50离子交换层析,用0—0.5M Nacl梯度冼脱即得c。酶纯品。全程序仅需二天时间。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳及SDS电泳鉴定均为单一带。此酶的分子量用SDS电泳及凝胶过滤法测定分别为58,000和5 2,000,用等电聚焦测其等电点为pH4 0。作用最适pH也为q o。此酶有较好的稳定性,在酸性pH(2 2)、碱性pH(8 0)及中性(水)中均能保持较长时间而不丧失活力。     

黑曲霉病毒含量与寄主葡萄糖淀粉酶产量之间的相关性

我国工业上广泛应用的葡萄糖淀粉酶生产菌黑曲霉(Aspergil nider)体内含有大量病毒。选择在育种筛选中葡萄糖淀粉酶产量不同的茁株,挑选不同方式保藏传代造成葡萄糖淀粉酶产量不同的菌株．纠及经化学试剂处理后葡萄糖淀粉酶产量不同的菌株。分别进行病毒提取,电镜观察、免疫双扩散、’H标记放射免疫测定病毒在体内的滴定度,’H标记后提取病毒及病毒核酸测定对体内病毒核酸的参入,及Pas—ELIsA(酶联A蛋白夹层酶联免疫吸附法Staphyllococ亡us pⅢeln^邮dwich E LlsA)与sA—test(病毒葡萄球菌共凝集试验Virus sta—phlococcal co-aggluintion test)检测病毒含量,并且测定了葡萄糖淀粉酶的产量．证实了黑曲霉细胞内病囊的含量与黑曲霉的葡萄铯淀粉酶产量之间呈正相关性。     

高温α-淀粉酶生产菌种选育的研究

以地衣芽孢杆菌B．198为出发株,经不同诱变剂反复诱变和自然选育,得到突变株A.404l,其产高温α-淀粉酶为出发株的100倍。在摇瓶培养条件下,酶活力达200u／ml．是一株无孢子并带有Rifr、Met-、Arg-标记的抗分解代谢阻遏突变株。初步纯化的A1041α-淀粉酶最适反应pH为5—7,晟适反应温度90—95℃,于90℃、60分钟处理不失活,表明突变株A．4041所产α-淀粉酶是高温淀粉酶,具有工业生产价值。     

高温α-淀粉酶生产菌种选育的研究

以地衣芽孢杆菌B．198为出发株,经不同诱变剂反复诱变和自然选育,得到突变株A.404l,其产高温α-淀粉酶为出发株的100倍。在摇瓶培养条件下,酶活力达200u／ml．是一株无孢子并带有Rifr、Met-、Arg-标记的抗分解代谢阻遏突变株。初步纯化的A1041α-淀粉酶最适反应pH为5—7,晟适反应温度90—95℃,于90℃、60分钟处理不失活,表明突变株A．4041所产α-淀粉酶是高温淀粉酶,具有工业生产价值。     

米黑毛霉(M.miehei)天冬氨酸蛋白酶的研究

用硫酸铵分部盐析及离子交换层析技术从米黑毛霉半固体培养物的浸提液中提纯了天冬氨酸蛋白酶,酶活力收率为19.5％,,比活力达3080SU/mg蛋白,提纯8.5倍。用聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-凝胶电泳、等电聚焦、双向免疫扩散及免疫电泳等方法鉴定该酶均一。本文还报道了关于该酶生化性质、动力学性质及化学修饰的研究结果。该酶以天冬氨酸为其活性的必需基团,系一典型的天冬氨酸蛋白酶。     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A_(236)热稳定葡萄糖淀粉酶的纯化及其特性

嗜热真菌ThermomyceslanuginosusA_236在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl－Toyopearl疏水层析、SephacrylS100凝胶过滤和FPLCMonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶为葡萄糖淀粉酶（EC3．2．1．3）。SDS－PAGE测定其分子量为72,000,不具亚基,PI为4．0,富含Val和Leu。酶反应最适温度和pH分别为70℃和5．0。在pH5．0条件下,酶在60℃保温1h,仍具有原酶活性。酶活性在70℃和80℃的半衰期分别为20min和6min。Ca2+对酶有激活作用,Fe3+、Al3+、Hg2+等金属离子对酶活力有一定的抑制作用。纯酶碳水化合物含量为12．4％。纯酶可水解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糊精、糖原、麦芽三糖和麦芽糖,其中可溶性淀粉为最适底物。     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A236热稳足葡萄糖淀粉酶的纯化及其特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A2a6在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、Sephacryl S100凝胶过滤和FPLC Mono Q离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶为葡萄糖淀粉酶(EC 3．2．1.3)。SDS-PAGE测定其分子量为72,000,不具亚基,pI为4．0,富含val和Leu。酶反应最适温度和pH分别为70℃和5．0。在pH5．0条件下,酶在60℃保温lh,仍具有原酶活性。酶活性在70℃和80℃的半衰期分别为20min和6min, Ca²⁺对酶有激活作用,Fe³⁺、Al³⁺、Hg²⁺等金属离子对酶活力有一定的抑制作用。纯酶碳水化合物含量为12．4％。纯酶可水解可溶性淀粉,直链淀粉、支链淀粉．糊精、糖原、麦芽三糖和麦芽糖,其中可溶性淀粉为最适底物。     

竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒凝血酶样酶的分离纯化及其理化性质的研究

用CM—Sephadex C—25分离竹叶青粗毒,再经DEAE—Sephadex A—50和CM—Sephadex C—25纯化得到凝血酶样酶组分Ⅰ。用DEAE—Sephadex A—50分离竹叶青粗毒,再经DEAE—Sepharose CL—6B纯化得到凝血酶样酶组分Ⅱ。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,组分Ⅰ在两种电泳中均为一条带; 组分Ⅱ在两朴电泳中均为二条带,经切割后鉴定证明组分Ⅱ的二条带都是凝血酶样酶。组分Ⅰ的分子量为54,500,由261个氨基酸残基组成,其中Asp和Glu含量较高,含14％中性己糖,13.1％己糖胺和14.7％唾液酸,等电点为3.5,在280nm处的消光系数为E_(1cm)~(0.1％)=0.855。组分Ⅱ的分子量分别为54,000和47,000。经凝胶电泳分离后用过碘酸—Schiff's试剂染色,证明组分Ⅰ和组分Ⅱ都是糖蛋白。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节——Ⅵ.拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rafai)N_2-78被槐糖诱导形成的纤维素酶组分的分离、纯化及性质

拟康氏木霉洗涤菌丝体被槐糖诱导形成的纤维素酶,经DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法,初步分离得到C_1酶、C_x酶和β-葡萄糖苷酶三个组分,其分子量经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,分别为67,000、62,000和42,000。C_1酶用聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、免疫电泳和超离心鉴定,已证明是匀一的组分,为糖蛋白,富含甘氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和谷氨酸。纤维素酶的三个组分对天然纤维素、微晶纤维素和或磷酸膨胀纤维素的作用存在协同效应。研究了纤维素酶组分的热稳定性及pH稳定性。     

小麦幼根和幼苗中几种同工酶的初步研究

利用水平板淀粉凝胶电泳法和盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳法,结合酶的染色法研究了小麦种子萌发后的胚、幼根和幼苗中过氧化物酶等6种同工酶及胚乳中淀粉酶同工酶的变化;测定了幼根和幼苗中过氧化物酶和吲乙酸氧化酶的活性。过氧化物酶和淀粉酶的同工酶数目随萌发大量增加。6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和酯酶在萌发初期的胚中就有不少同工酶带和较强的活性。过氧化物酶、吲乙酸氧化酶和谷氨酸脱氢酶在根中比在苗中活性大得多,相反,过氧化氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶在苗中比在根中活性大得多,酯酶在苗中比在根中活性稍大,只有异柠檬酸脱氢酶在根和苗中无甚差异。同工酶带的数目及其相对强度的不同可能与器官差异有关。此研究有助于进一步探讨不同组织和器官在分化时具有不同的代谢特点。     

米曲霉6—193α-淀粉酶的纯化和性质的研究

米陆霉(Aspergillus oryzae)突变株6—193的麦麸固体培养物,经水浸泡其中α-淀粉酶活力为每克干曲600单位。用硫酸铵分段沉淀．Sephadex G_75凝胶过滤和制备垂直平板电泳纯化,经PAGE鉴定为一条带,SDS凝胶电泳测定分子量为52,000。酶作用最适PH为5.0-6．0,最适温立为60℃。在60℃处理30分钟酶活力保留90％．加Ca2+后,酶的热急定性有提高。Ca2+、Li+和Mg2+对酶有一定的激活作用,而Ag+、Al3+、Fe2+、Cu2+、cr3+、Hg2+、Zn2+和Mn2+等对酶均有抑制作用。酶作用产物经薄层色谱分析,扫描,所产生的二糖和三糖之和为69 4％。     

猪肺血管紧张素转换酶的提纯

本文报道了猪肺血管紧张素转换酶(ACE)的提纯方法及其鉴定,并讨论了方法的改进。肺匀浆经1.6—2.6mol/L硫酸铵沉淀,Sephadex G-200凝胶过滤,DEAE-Sephaeel及羟基磷灰石柱层析步骤,从168克肺中获得4.5毫克酶蛋白纯品。活力回收45.2％,比活力15.6单位/毫克蛋白;和匀浆上清比较,提纯390倍。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH8.3)鉴定为一条带。按SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得其分子量为132,000道尔顿。酶蛋白在-30℃貯存10月,比活力丢失30％。     

二株高活力纤维素分解菌EA3-867和N2-78的获得及其特性的比较

拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rifai)野生型菌株AS 3．3002和木3,分别经多种物理化学因素(高能电子、60钴、紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯等)诱变处理后,得到二株变异菌株EA3,-867和N2-78。它仉的固体曲、液体曲和酶制剂的各项纤维紊酶活力测定结果,均比野生型菌株明显提高。N2-78菌株经摇瓶培养60小时,其CMC糖化力为255毫克葡萄糖／毫升酶液,滤纸糖化力为8．2毫克葡萄糖／毫升酶液,棉花糖化力为13．4毫克葡萄糖／毫升酶液,分别比野生型菌株提高H．6倍、5．3倍和7倍。由EA3-867和N2-78的固体曲制取的纤维素酶粗制剂,其各项纤维紊酶话力测定结果,均较Onozuka R-10纤维索酶制剂为高。上述野生型菌株及变异菌株均具有果胶酶、半纤维紊酶、淀粉酶和少置蛋白酶的活力。变异菌株中果胶酶的活力较野生型菌株为高,淀粉酶和蛋白酶活力则较低。同时,变异菌株的形态也与原始菌株有明显差异。上述四株菌的孢子致死温度相同,CMC糖化、滤纸崩溃和滤纸糖化的最适pH相近,最适温度相同,分别为pH 4.4、60℃,pH4.8、60℃和pH4.8、60℃。     

分枝犁头霉a-半乳糖苷酶的纯化和性质

分枝犁头霉菌丝体球经金刚砂磨碎用水提取的粗酶液,用两种方法纯化,一是用制备垂直平板凝胶电泳;另一是经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-200、DEAE-Sephadcx A50及羟基磷灰石等柱层析。这两种方法纯化后的样品经PACE鉴定皆为均一带,无其他糖苷酶活性。酶反应最适温室为55—60℃,在50℃保温7h,剩余活力为50％,70℃保温10min,则全部失活。最适pH为5．0,pH6．0一8．5稳定。