RNAi沉默CXCR7对人结肠癌细胞SW620特异性靶向抑制的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法:(1)设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;(2)将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7 mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验表达载体;(3)MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;(4)通过细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;(5)Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果:(1)测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别为3.16×108TU/ml、4.27×108TU/ml、3.93×108TU/ml和2.95×108TU/ml;(2)3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P0.05);(3)CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有显著性差异(P0.05);(4)SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,有统计学意义(P0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,有统计学意义(P0.05);(5)CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P0.05)。结论:CXCR7-shRNA慢病毒表达载体转染SW620细胞后可有效下调CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平并能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,为下一步研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的结直肠癌慢病毒基因沉默治疗打下了良好的基础,为结直肠癌的基因治疗提供了新方向。     

siRNA抑制S100A4表达对卵巢癌细胞CP70生物学特性的影响

目的：探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70沉默S100A4基因后,CP70细胞对顺铂敏感性、凋亡及细胞迁移的影响。方法：设计并合成S100A4基因特异性的siRNA并转染入卵巢癌细胞CP70,48 h后应用RT-PCR和Western Blot检测在mRNA和蛋白水平siRNA对S100A4的影响,MTT法检测转染siRNA后卵巢癌细胞CP70对顺铂敏感性的变化。用流式细胞术检测顺铂（40μM）对转染S100A4 siRNA后对卵巢癌细胞CP70凋亡的影响,Transwell法观察siRNA抑制S100A4后对卵巢癌CP70迁移能力的影响。结果：与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4siRNA转染组CP70细胞的S100A4基因和蛋白表达降低（P〈0.01）。MTT法检测顺铂敏感性发现S100A4 siRNA转染组CP70细胞顺铂敏感性增强。在顺铂刺激下,siRNA转染组细胞凋亡率高于其他各组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。Transwell发现CP70细胞迁移能力明显下降（P〈0.05）。结论：S100A4 siRNA能够明显抑制CP70细胞S100A4的表达,从而增强细胞对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡,减弱细胞的迁移能力。S100A4有望成为逆转卵巢癌铂类耐药的治疗靶点。     

siRNA抑制c-myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:利用siRNA(small interference RNA)技术研究c-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法:依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对c-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA.通过阳离子聚合物jet-SITM-ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA-scr转染细胞为对照.用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响.流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT-PCR法比较转染前后c-myc mRNA表达水平的变化.结果:细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定.c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组.结论:体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖.     

siRNA抑制S100A4 表达对卵巢癌细胞CP70生物学特性的影响

摘要 目的：探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70沉默S100A4 基因后,CP70细胞对顺铂敏感性、凋亡及细胞迁移的影响。方法：设计并合成S100A4基因特异性的siRNA并转染入卵巢癌细胞CP70,48 h后应用RT-PCR和Western Blot检测在mRNA和蛋白水平siRNA对S100A4的影响,MTT法检测转染 siRNA后卵巢癌细胞CP70对顺铂敏感性的变化。;用流式细胞术检测顺铂（40 μM） 对转染S100A4 siRNA后对卵巢癌细胞CP70凋亡的影响,Transwell法观察siRNA抑制S100A4后对卵巢癌CP70迁移能力的影响。 结果：与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4 siRNA转染组CP70细胞的S100A4基因和蛋白表达降低(P<0.01)。MTT法检测顺铂敏感性发现S100A4 siRNA转染组CP70细胞顺铂敏感性增强。在顺铂刺激下,siRNA转染组细胞凋亡率高于其他各组,差异具有统计学意义（P<0.05）。Transwell发现CP70细胞迁移能力明显下降（P<0.05）。结论：S100A4 siRNA能够明显抑制CP70细胞S100A4的表达,从而增强细胞对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡,减弱细胞的迁移能力。S100A4有望成为逆转卵巢癌铂类耐药的治疗靶点。     

沉默YAP基因抑制卵巢癌细胞增殖及Warburg效应

为了通过卵巢癌OVCAR-3细胞实验探讨YAP基因对卵巢癌增殖的影响,本研究通过MTT法检测卵巢癌细胞增殖情况,借助蛋白免疫印迹法检测卵巢癌细胞中PDK-1、PDH和LDHA蛋白的表达情况;通过乳酸检测试剂盒检测卵巢癌细胞中乳酸的产量。研究表明YAP-siRNA转染后,与空载体对照组相比,YAPsi RNA卵巢癌细胞转染组细胞增殖率明显增加(p0.05);YAP-siRNA转染后,与空载体对照组相比,YAP-siRNA卵巢癌细胞转染组细胞中PDK-1蛋白和LDHA蛋白表达明显增加,PDH蛋白表达显著降低(p0.05);YAPsi RNA转染后,与空载体对照组相比,YAP-siRNA卵巢癌细胞转染组乳酸产量明显增加(p0.05)。研究结果初步表明:沉默YAP基因能够抑制卵巢癌细胞增殖,其机制可能与调控Warburg效应有关。     

siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

SiRNA-VEGF对子宫内膜癌ishikawa细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究针对VEGF的RNAi技术对人子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞中VEGF的抑制作用及对细胞生长、增殖的影响。方法:设计并合成针对VEGF序列特异性siRNA及阴性对照siRNA,转染ishikawa细胞,分别于转染后12h、24h、48h、72h、7d后提取细胞RNA,应用实时荧光定量PCR检测其对VEGF mRNA表达水平的影响,MTT法检测细胞增殖的情况,于转染后48h收集细胞软琼脂培养检测细胞克隆形成能力。结果:转染针对siRNA-VEGF的ishikawa细胞,于转染后12h、24h、48h、72h VEGF mRNA表达水平明显下降、细胞增殖受到明显的抑制,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),于转染后7天这种抑制作用消失(P>0.05)。转染后48h实验组细胞克隆形成率低于对照组(P<0.05)。结论:针对VEGF的RNAi技术可有效抑制子宫内膜癌细胞系ishikawa细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞生长增殖及细胞集落形成能力,提示VEGF基因在子宫内膜癌的发生、发展中可能具有重要作用,为进一步利用RNAi技术抑制肿瘤生长、血管形成及局部侵袭和远处转移提供研究基础。     

siRNA沉默Survivin基因对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的影响

合成Survivin小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,用于转染人鼻咽癌细胞株CNE2,体外观察Survivin siRNA转染后CNE-2细胞Survivin mRNA、蛋白的表达、细胞增殖和凋亡情况。设计合成3段特异性Survivin siRNA,用siRNA转染鼻咽癌CNE-2细胞株,设置空白对照和阴性对照组,通过Real-time PCR检测CNE-2细胞的Survivin mRNA相对表达量,Western blotting检测Survivin蛋白的表达,流式细胞术及原位细胞凋亡检测转染后细胞凋亡情况。siRNA转染CNE-2细胞后,siRNA 1组和3组mRNA表达抑制率分别为(68.46±7.94)%、(49.44±3.78)%,siRNA 2组结果无显著差异(p0.05)。蛋白相对表达量只有siRNA 1组降低,表达抑制率为(30.61±2.47)%,流式细胞术和原位细胞凋亡检测转染后CNE-2细胞数量明显降低,细胞凋亡比例增高。siRNA干扰沉默Survivin基因能有效抑制CNE-2细胞的增殖和诱导细胞凋亡。本研究为Survivin基因可能作为治疗鼻咽癌的一个靶点,为Survivin基因沉默可能是治疗鼻咽癌高效的途径提供体外实验支持。     

siRNA表达载体对SW480细胞原癌基因Pokemon的抑制

观察siRNA表达载体对SW480细胞中Pokemon原癌基因的抑制效应,为进一步研究该基因的功能奠定基础。构建针对Pokemon基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染人结直肠癌SW480细胞系,观察转染效率及细胞表型变化。稳定转染后,实时荧光定量PCR和Western blot检测SW480细胞中Pokemon mRNA及蛋白质的表达情况;MTT法检测siRNA对SW480细胞恶性增殖的影响;流式细胞仪分析细胞凋亡改变。镜下观察阳性转染率约36%,转染表达载体后细胞形态发生了显著变化;Pokemon mRNA及蛋白质的表达受到明显抑制：与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对Pokemon mRNA的抑制率在转染后24 h和48 h分别为34.2%和67.7%;对蛋白的抑制率在48 h和72 h分别为48.3%和73.6%。MTT法检测细胞生长曲线表明Pokemon抑制可使SW480细胞生长速度明显减慢;流式细胞仪分析显示转染Pokemon siRNA表达质粒后SW480细胞凋亡增加。构建的RNAi表达载体可以有效抑制SW480细胞中Pokemon基因的表达,并对SW480细胞的生长具有明显抑制及诱导凋亡作用。     

RNA干扰敲低β-catenin的表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨β-catenin对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)增殖和凋亡的影响。方法:分别采用Real-time PCR(RT-PCR)和Western blot检测正常组织和瘢痕疙瘩中β-catenin的mRNA及蛋白表达。将针对人β-catenin基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人瘢痕成纤维细胞β-catenin基因表达的最佳siRNA。通过siRNA沉默β-catenin表达后,采用MTT法检测KFB的增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:瘢痕疙瘩成纤维细胞中β-catenin的表达较正常组织明显升高(P0.05)。通过转染β-catenin siRNA降低其表达后,成纤维细胞的增殖能力明显下降(P0.05),凋亡水平显著增高(P0.05)。结论:沉默β-catenin能够显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并促进其凋亡。     

The N-terminal polypeptide derived from vMIP-II exerts its antitumor activity in human breast cancer through CXCR4/miR-7-5p/Skp2 pathway

Breast cancer is a malignant tumor with the highest incidence in women of the world. CXCR4 and Skp2 are highly expressed in breast cancer cells and CXCR4 was positively correlated with Skp2 by interference or overexpression. The microRNA array was used to detect the differentially expressed spectrum of micro RNAs in breast cancer cells the changes of miR-7-5p after CXCR4 inhibitor (NT21MP) treatment to block the CXCR4/SDF-1 pathway was founded. MiR-7-5p has been found to be correlated with Skp2 in various tumors in the literature, and Skp2 expression can be regulated by transfection with miR-7-5p mimics or inhibitors. The expression level of miR-7-5p was upregulated or downregulated after CXCR4 interference or overexpression. Combined with the correlation between CXCR4 and miR-7-5p in the chip results, CXCR4 may regulate Skp2 through miR-7-5p. Epithelial cells have the morphological characteristics of mesenchymal cells for some reason called epithelial–mesenchymal transformation (EMT). Transfection of miR-7-5p mimics into drug-resistant cells reduced Skp2 levels, decreased the expression of Vimentin, Snail, and slug, and increased the expression of E-cadherin. CXCR4 inhibitor (NT21MP) can reverse the EMT changes caused by miR-7-5p inhibitor. Similarly, in vivo results suggesting that CXCR4 inhibitors can reverse the EMT phenotype of drug-resistant breast cancer cells through the CXCR4/miR-7-5p/Skp2 pathway. In summary, the CXCR4/miR-7-5p/Skp2 signaling pathway plays an important role in the progression of breast cancer. This study provides a theoretical basis for the treatment of breast cancer by targeting the CXCR4 pathway.     

逆转录病毒介导的siRNA对宫颈癌细胞CXCR4表达的抑制

目的：观察逆转录病毒介导RNA干扰抑制宫颈癌Caski细胞CXCR4基因表达的效率。方法：人工合成CXCR4特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段,装入带有绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒载体pSOS,先转染PT67细胞包装成病毒,收获病毒上清,再将其转染Caski细胞,采用实时定量PCR和Western blotting观察CXCR4表达受抑的情况。结果：成功构建pSOS-CXCR4载体,并发现在24、48和72h,CXCR4 mRNA的抑制率分别为29.9%,56.8%和62.8%,CXCR4蛋白的抑制率分别为43.6%,49.6%和62.9%。结论：逆转录病毒介导RNA干扰能有效抑制宫颈癌细胞CXCR4表达。     

HGF-induced PKCζ activation increases functional CXCR4 expression in human breast cancer cells

The chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12 have been shown to mediate the metastasis of many malignant tumors including breast carcinoma. Interaction between hepatocyte growth factor (HGF) and the Met receptor tyrosine kinase mediates development and progression of cancers. HGF is able to induce CXCR4 expression and contributes to tumor cell invasiveness in breast carcinoma. However, the mechanism of the CXCR4 expression modulated by c-Met-HGF axis to enhance the metastatic behavior of breast cancer cells is still unclear. In this study, we found that HGF induced functional CXCR4 receptor expression in breast cancer cells. The effect of HGF was specifically mediated by PKCζ activity. After transfection with PKCζ-siRNA, the phosphorylation of PKCζ and CXCR4 was abrogated in breast cancer cells. Interference with the activation of Rac1, a downstream target of HGF, prevented the HGF-induced increase in PKCζ activity and CXCR4 levels. The HGF-induced, LY294002-sensitive translocation of PKCζ from cytosol to plasma membrane indicated that HGF was capable of activating PKCζ, probably via phosphoinositide (PI) 3-kinases. HGF treatment also increased MT1-MMP secretion. Inhibition of PKCζ, Rac-1 and phosphatidylinositol 3-kinase may attenuate MT1-MMP expression in cells exposed to HGF. Functional manifestation of the effects of HGF revealed an increased ability for migration, chemotaxis and metastasis in MDA-MB-436 cells in vitro and in vivo. Our findings thus provided evidence that the process of HGF-induced functional CXCR4 expression may involve PI 3-kinase and atypical PKCζ. Moreover, HGF may promote the invasiveness and metastasis of breast tumor xenografts in BALB/c-nu mice via the PKCζ-mediated pathway, while suppression of PKCζ by RNA interference may abrogate cancer cell spreading.     

人BRCA1 干涉慢病毒载体的构建与验证

目的:设计合成干涉BRCA1表达的小干扰RNA,并克隆入pLKO.1慢病毒表达载体,为研究基因BRCA1在乳腺癌细胞增殖中的作用提供基础。方法:根据人BRCA1的基因序列,设计合成三对BRCA1干涉片段(序列前后加入酶切位点EcoRI和AgeI),再利用酶切连接反应将其插入到慢病毒载体pLKO.1中,经过酶切鉴定及测序正确后,将重组质粒转染入MCF-7细胞,48h后提取蛋白质和RNA,通过蛋白印迹验证BRCA1的蛋白水平的表达情况,Realtime PCR验证BRCA1的RNA水平的表达变化。结果:重组质粒经酶切鉴定和测序比对完全正确,转染乳腺癌细胞48h后可见BRCA1表达的明显下调。结论:成功构建BRCA1干涉的慢病毒载体,并且转染MCF-7细胞证实其能够下调BRCA1的表达,为后续研究BRCA1在乳腺癌细胞的功能奠定了基础。     

Upregulation of surface feline CXCR4 expression following ectopic expression of CCR5: implications for studies of the cell tropism of feline immunodeficiency virus

Feline CXCR4 and CCR5 were expressed in feline cells as fusion proteins with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Expression of the EGFP fusion proteins was localized to the cell membrane, and surface expression of CXCR4 was confirmed by using a cross-species-reactive anti-CXCR4 monoclonal antibody. Ectopic expression of feline CCR5 enhanced expression of either endogenous feline CXCR4 or exogenous feline or human CXCR4 expressed from a retrovirus vector, indicating that experiments investigating the effect of CCR5 expression on feline immunodeficiency virus (FIV) infection must be interpreted with caution. Susceptibility to infection with cell culture-adapted strains of FIV or to syncytium formation following transfection with a eukaryotic vector expressing an env gene from a cell culture-adapted strain of virus correlated with expression of either human or feline CXCR4, whereas feline CCR5 had no effect. In contrast, neither CXCR4 nor CCR5 rendered cells permissive to either productive infection with primary strains of FIV or syncytium formation following transfection with primary env gene expression vectors. Screening a panel of Ghost cell lines expressing diverse human chemokine receptors confirmed that CXCR4 alone supported fusion mediated by the FIV Env from cell culture-adapted viruses. CXCR4 expression was upregulated in Ghost cells coexpressing CXCR4 and CCR5 or CXCR4, CCR5, and CCR3, and susceptibility to FIV infection could be correlated with the level of CXCR4 expression. The data suggest that beta-chemokine receptors may influence FIV infection by modulating the expression of CXCR4.     

大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用, 构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs (rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列, 设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面, 产生pRiCXCR4, 将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP, 产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞, 包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后, 用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示, 酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确, 产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP, 未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后, 与空载体组和空白组相比, 3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达, CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%, 抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功, 为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。     

用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达，降低肝细胞中胆汁酸的分泌

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02).根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野生型L-02细胞和仅转染pSicoR空载体的L-02细胞作对照,观察肝细胞胆固醇7α羟化酶的表达以及培养上清中总胆汁酸含量.利用半定量PCR、实时荧光定量PCR及Western-blot等实验方法检测了转染细胞中基因的干涉效果,结果显示:与对照组相比,在mRNA水平,转染慢病毒siRNA载体的L-02细胞,其胆固醇7α羟化酶基因的表达量仅为野生型L-02细胞表达量的31.2%,为转染pSicoR空载体的L-02细胞的34.1%,干涉效率分别为68.8%和65.9%,均具有显著差异(P＜0.05);Western-blot结果显示胆固醇7α羟化酶在蛋白质水平表达也明显受到抑制,表明转染慢病毒siRNA下调了肝细胞中胆固醇7α羟化酶基因的表达,减少了胆汁酸的分泌.以上研究结果表明,利用RNAi技术可以获得低表达胆固醇7α羟化酶基因的肝细胞,并有效降低肝细胞中胆汁酸的分泌,为临床上生物人工肝的构建及应用奠定基础.     

Smo基因在人肝癌Huh-7细胞中的表达及小RNA干扰Smo基因表达对肝癌Huh-7细胞增殖及凋亡的影响

目的:在细胞学层面上研究Smo基因在人肝癌Huh-7细胞中的表达及小RNA干扰Smo基因表达对肝癌Huh-7细胞增殖及凋亡的影响。方法:Huh-7细胞培养,总RNA抽提,紫外分光光度计纯度测定,Western印记法检测Smo蛋白表达,转染后流式细胞检测Huh-7凋亡率。结果:在mRNA和蛋白水平Smo均强表达。siRNA-1干扰序列干扰结果最强,转染后可诱导Huh-7细胞凋亡。结论:siRNA-l能对肝癌Huh7细胞Smo基因表达产生干涉作用,siRNA-1序列能有效地降解肝癌Huh7细胞内的SmomRNA,使Smo mRNA及Smo蛋白表达下调,从而达到沉默肝癌Huh7细胞中Smo mRNA表达的效果。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。