神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.     

NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.     

小鼠脐血移植模型研究进展

脐血中含有丰富的原始造血干细胞,由于免疫细胞发育不成熟,抗原表达和功能活性低下,移植物抗宿主疾病发生率低。脐血来源丰富、不易受病毒及残留肿瘤细胞的污染,越来越多地作为造血干细胞的优质来源在临床上广泛应用。通过建立小鼠脐血移植模型,对临床多种疾病尤其是对恶性血液病的造血干细胞移植研究提供有效途径,可以对脐血的生物学功能、植入过程、移植疗效做进一步研究,不断优化的小鼠移植模型对我们解读人类疾病的发病机理、疾病进程起到推动作用,本文将从小鼠种属的选择、移植模型的构建及脐血移植模型新进展等方面对进行综述。     

用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达，降低肝细胞中胆汁酸的分泌

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02).根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野生型L-02细胞和仅转染pSicoR空载体的L-02细胞作对照,观察肝细胞胆固醇7α羟化酶的表达以及培养上清中总胆汁酸含量.利用半定量PCR、实时荧光定量PCR及Western-blot等实验方法检测了转染细胞中基因的干涉效果,结果显示:与对照组相比,在mRNA水平,转染慢病毒siRNA载体的L-02细胞,其胆固醇7α羟化酶基因的表达量仅为野生型L-02细胞表达量的31.2%,为转染pSicoR空载体的L-02细胞的34.1%,干涉效率分别为68.8%和65.9%,均具有显著差异(P＜0.05);Western-blot结果显示胆固醇7α羟化酶在蛋白质水平表达也明显受到抑制,表明转染慢病毒siRNA下调了肝细胞中胆固醇7α羟化酶基因的表达,减少了胆汁酸的分泌.以上研究结果表明,利用RNAi技术可以获得低表达胆固醇7α羟化酶基因的肝细胞,并有效降低肝细胞中胆汁酸的分泌,为临床上生物人工肝的构建及应用奠定基础.     

脐带间充质干细胞治疗儿童重型免疫性血小板减少症的探索性研究

目的探讨脐带间充质干细胞（UC-MSC）输注治疗儿童重型免疫性血小板减少症（s ITP）的疗效及安全性。方法采用UC-MSC治疗儿童s ITP 3例。发病年龄为3个月至4岁,初治时血小板计数为（1-7）×10^9/L,3例均为s ITP,均出现严重出血,激素及免疫抑制剂无效或依赖。后给予2-3次（1次/周）静脉输注非血缘UC-MSC,输注细胞量为（1-2）×10^6/kg。输注后密切监测血象及肝肾功能等各项指标,观察疗效及不良反应。结果随访时间15-45个月,3例在输注细胞后渐显效：第1例在输注细胞后20 d血小板达到65×10^9/L,随访4个月,血小板均维持在1×10^11/L以上;第2例在输注细胞后41 d血小板达105×10^9/L,之后血小板一直维持正常;第3例在输注第2次细胞后血小板渐上升至2×10^11/L以上。输注过程中1例出现面色发红,1例出现血压升高,随访至今无明显不良反应。结论 UC-MSC对儿童重型ITP有一定的疗效,能提高儿童的生活质量;有必要扩大病例数,进一步研究UC-MSC治疗儿童ITP的疗效及机制。     

胚胎干细胞的诱导分化研究

胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞, 具有发育上的全能性. 近两年在ES细胞诱导分化方面的研究取得了一些突破性的进展, 其中, ES细胞向生殖细胞分化(2003年)以及首次克隆成功人ES细胞(2004年)先后被评为《科学》杂志当年度十大科学进展之一; 另外, 维持ES细胞不分化状态的关键基因(Nanog)及相关化合物(BIO)的发现, 其自身分化状态调控机理的深入研究, 以及向不同方向诱导分化和应用等的研究成果, 同样受人关注.