‘砀山酥梨’及其褐色果皮芽变PbXET基因克隆与表达分析

为研究‘砀山酥梨’及其褐皮芽变木葡聚糖转葡糖苷酶基因(PbXET)表达水平差异,该实验利用RACE技术,克隆了梨PbXET基因;采用实时荧光定量PCR技术,分析了梨树叶片、果皮和果肉等不同组织及花后不同时期果皮中PbXET基因表达差异。结果表明:(1)梨PbXET3(KJ690921)和PbXET4(KJ690922)开放阅读框分别为903bp和891bp,分别编码300和296个氨基酸;氨基酸序列聚类分析显示,PbXET3与苹果MdXET-3以及PbXET4与苹果MdXET-5的亲缘关系最近。(2)半定量PCR分析显示,花后150d,PbXET3和PbXET4基因在‘砀山酥梨’和‘锈酥’不同组织中均有表达,且PbXET3在叶片中表达量很低,在果皮、果肉中表达相对较强,其中叶片中PbXET3表达量低于PbXET4,而果肉和果皮中PbXET3的表达均明显高于PbXET4。(3)荧光定量PCR分析发现,在‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中,PbXET3和PbXET4基因不同时期的表达量变化趋势不同;与‘砀山酥梨’相比,果皮颜色发生变化(花后100d)之后,‘锈酥’果皮中PbXET3表达量骤减;而果皮颜色发生变化(花后100d)之前,PbXET4表达量均显著降低。由此推测,PbXET3和PbXET4基因参与了‘锈酥’果皮褐色形成的调节,其表达水平差异可能是改变‘锈酥’表皮细胞结构的重要原因之一。     

‘砀山酥梨’褐皮芽变中两个ERF基因的克隆与表达分析

为了解梨(Pyrus bretschneideri)中ERF基因的功能, 采用3'' RACE 和PCR 技术从‘砀山酥梨’中克隆了两个ERF基因, 并对其表达进行了分析。克隆的两个ERF基因都具有典型的AP2/ERF 结构域, 属于ERF基因家族, 分别命名为PbERF2 和PbERF4, GenBank 登录号分别为KJ623716 和KJ623718。系统进化分析表明, PbERF2 与枇杷ERF1, PbERF4 与黄瓜ERF1的亲缘关系较近。表达分析表明, PbERF2 和PbERF4 在叶片中几乎不表达, 果皮中的表达量高于果肉;‘锈酥’果皮3 个发育时期的PbERF2 和 PbERF4 表达量均显著高于‘砀山酥梨’, 且均呈现先上升后下降的趋势。这为深入研究梨ERF基因家族的作用机理提供了理论依据。     

砀山酥梨石细胞发育过程中PPO酶学特性及其cDNA片段克隆

以砀山酥梨果实为材料,研究了影响石细胞形成的木质素合成酶-多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的酶学特性,并对PPO基因进行了克隆.结果表明,在砀山酥梨果实发育的过程中,PPO活性在花后27 d和47 d出现高峰,早于木质素含量高峰(花后47 d、61 d)和石细胞团含量高峰(花后51 d),且P...     

荔枝果实发育过程中内源多胺含量的变化

荔枝果实中多胺含量以亚精胺(Spd)最高,腐胺(Put)其次,精胺(Spm)最低,三者分别于花后7 d和28 d各出现1个高峰.果皮、假种皮和种子中总多胺含量以各自发育初期为最高,随后急速下降,快速膨大期间的变化则不大.花后0～21 d,单果中Put、Spd和Spm含量最低;花后28 d,出现第1个小高峰;果实快速膨大期Spd含量急剧升高,Put和Spm升高较慢.     

''砀山酥''梨果实发育过程中几种酶的谱带和活性变化

幼果期间,‘砀山酥’梨果实中的过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的总活性高,同工酶谱带数多,而后,随着果实的生长发育而下降并趋于稳定,花后90d左右出现一条特异性POD同工酶条带;超氧化物歧化酶（SOD）的同工酶谱带和活性在整个发育过程中变化不明显。     

NaCl胁迫对菜用大豆种子多胺代谢的影响

采用蛭石栽培,在100 mmol·L-1NaCl胁迫下,对耐盐性不同的两个品种菜用大豆种子的丙二醛(MDA)含量和多胺(PAs)代谢进行了研究.结果表明:NaCl胁迫显著增加了菜用大豆种子的MDA含量,但耐盐品种‘绿领特早’(LL)的增幅低于盐敏感品种‘理想高产95-1’(LX).与LX相比,LL种子在整个NaCl胁迫期间均维持了相对较高的游离态精胺(Spm)、结合态Spm、结合态亚精胺(Spd)、束缚态Spd和束缚态腐胺(Put)含量,较高的(Spd +Spm )/Put 和(cPAs+bPAs)/fPAs值及较低的Put/PAs值,在胁迫中、后期(9～15 d)维持了相对较高的游离态Spd含量;胁迫期间,LL的精胺酸脱羧酶(ADC)长时期(6～15 d)保持相对较高的活性,而多胺氧化酶(PAO)则长时期(6～15 d)维持相对较低的活性.综上,LL具有较强的多胺合成能力及较强的Put向Spd和Spm以及游离态多胺向结合态和束缚态多胺转化的能力,进而有效抑制了细胞的膜脂过氧化,这可能是其耐盐性较强的重要原因之一.     

嫁接对薄皮甜瓜果皮和果肉中乙酸己酯合成途径的影响

以薄皮甜瓜‘玉美人’为接穗,进行嫁接栽培,结果表明：嫁接降低了花后30d和35d果皮中乙酸己酯含量,对果肉中无显著影响。在花后30d果皮和果肉组织中分别添加乙酸己酯合成的不同阶段前体,进行芳香物质的测定表明,嫁接主要降低了甜瓜果皮中己酸向乙酸己酯的转化,而对醛和醇向酯的转化没有影响;果肉中3种前体向乙酸己酯的转化均未受嫁接影响。嫁接降低了花后35d甜瓜果皮中脂氧合酶（LOX）、醇脱氢酶（ADH）和醇酰基转移酶（AAT）的活性,对两个时期果肉中相关酶活性影响不同。     

红肉葡萄果实发育过程中花青苷组分变化与基因表达规律分析

以红肉葡萄新种质‘钟山红玉’为实验材料,通过高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测‘钟山红玉’从幼果到成熟期果皮、果肉中的花青苷组分及含量,并利用实时荧光定量PCR检测不同发育时期花青苷合成相关基因的表达水平,研究其不同果实发育时期果皮、果肉中的花青苷组分变化,以及相关基因表达规律,探索红肉葡萄果实呈色机制,为葡萄果实品质改良育种提供理论依据。结果表明:(1)‘钟山红玉’果皮和果肉中共检测出13种花青苷且都为单糖苷花青苷,与欧亚种葡萄亲缘关系较近。(2)‘钟山红玉’果皮、果肉中均检测出了欧亚种葡萄中很少有的天竺葵素3-O-葡萄糖苷;果皮中飞燕草素类(飞燕草素-、锦葵色素-、矮牵牛素-)花青苷衍生物含量显著高于矢车菊素类(矢车菊素-、芍药素-)花青苷衍生物,而在果肉中则两大类花青苷含量相近,这与果皮中较高的F3′5′H基因表达量有关,且在果皮中酰基化花青苷比例显著高于果肉。(3)花青苷合成相关基因MYBA2和UFGT在‘钟山红玉’不同发育时期的表达变化规律一致,UFGT基因在果肉中基本不表达,而MYBA2可能是决定‘钟山红玉’果肉转色的关键因子;并且ABA响应相关基因PYL1在‘钟山红玉’发育时期的表达规律与OMT和LDOX基因一致。     

葡萄果实成熟期花色苷与白藜芦醇合成相关基因的表达

以酿酒葡萄‘赤霞珠’为试材,采用pH示差法和高效液相色谱(HPLC)法分别测定葡萄成熟期果皮花色苷和白藜芦醇含量,用实时荧光定量PCR检测两者合成途径中相关基因的表达量,分析花色苷含量和白藜芦醇含量与其相关基因表达的关系,以揭示结构基因与调控基因的调控机制,为筛选富含花色苷和白藜芦醇的酿酒葡萄提供理论依据。结果显示:(1)葡萄果皮花色苷含量在花后112d达到最高值(0.77mg/g),反式白藜芦醇含量在花后126d达到最高值(30.87μg/g)。(2)花色苷和白藜芦醇合成途径中,CHSs、CHI、STS、UFGT、MybA1、MybA2基因的表达量除花后98d下调外,其余时间均呈上调表达,而Myb5a则始终呈上调表达。(3)相关分析表明,STS基因表达量与CHS1、CHS2基因表达量呈极显著和显著正相关关系,MybA1、MybA2基因表达量与CHSs、CHI、STS、UFGT基因的表达量呈极显著正相关关系;Myb5a基因表达量与CHS3基因表达量呈极显著正相关关系。研究表明,部分结构基因的表达与花色苷和白藜芦醇的变化不同步,MybA1和MybA2可能调控花色苷合成途径中多个结构基因的表达,花色苷与白藜芦醇的关系并不固定,而是处在动态变化中。     

‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω 羟基棕榈酸O 阿魏酰转移酶（ω hydroxypalmitate O feruloyl transferase, HHT）基因cDNA的全长,命名为 PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335 bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT PCR）表达分析显示,2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6~9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。     

石榴4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆和表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)是木质素合成途径的关键酶。该研究以‘红玉石籽’(Punica granatum cv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法获得4CL同源基因Pg4CL。Pg4CL基因cDNA全长2 121bp,编码544个氨基酸;序列比对和功能域分析发现,Pg4CL包含有2个保守域SSGTTGLPKGV和GEICIRG;系统进化树分析显示,Pg4CL与其他物种起源相同,而与赤桉Ec4CL亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,Pg4CL基因在叶、果皮、种皮和茎等组织中均有表达,其中果皮和叶片中表达量较高,种皮中表达量最低;Pg4CL基因在6个石榴品种的种皮中均有表达,其中在‘突尼斯软籽’中表达较高,‘会理软籽’表达量最低;Pg4CL基因在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达,在15~60d相对表达量逐步上升,并在60d时达到最高;75d以后表达量急剧下降,仅维持较低水平表达。     

砧木类型对甜樱桃花芽多胺代谢相关基因表达和休眠的影响

为验证砧木类型对甜樱桃多胺代谢和花芽休眠的影响,该研究以嫁接于不同砧木——矮化砧木‘吉塞拉6号’[Gisela 6,(G6)]和乔化砧木‘马扎德’(Mazzard)的甜樱桃品种‘罗亚理’为试材,通过田间观察确定嫁接于两种砧木的‘罗亚理’休眠期和花期,利用生物信息学、基因克隆、实时荧光定量、亚细胞定位和双分子荧光互补等手段,对甜樱桃花芽内多胺代谢中关键基因[多胺氧化酶基因(PavPAOs)和精氨酸脱羧酶基因(PavADC)]进行克隆和功能分析,对可能与PavADC存在互作关系的蛋白进行预测和验证,并利用高效液相色谱法对花芽内游离多胺的含量进行测定。结果表明:(1)‘Mazzard-罗亚理’的休眠期(75 d)长于‘G6-罗亚理’(69 d),且初花期晚于‘G6-罗亚理’。(2)‘G6-罗亚理’花芽内游离多胺含量高于‘Mazzard-罗亚理’,其中Put含量高1.2%~163.4%,Spd含量高8.8%~261.1%,Spm仅在1月和3月的‘G6-罗亚理’花芽中检测到。(3)成功克隆获得甜樱桃多胺代谢关键基因PavPAO2、PavPAO4、PavPAO5和PavADC,其长度分别为1485、1611、1704和2307 bp;系统进化分析表明,甜樱桃PavPAOs和PavADC均与桃、扁桃和苹果等物种的亲缘关系较近;亚细胞定位显示,PavPAO2和PavPAO4定位在细胞膜,而PavPAO5和PavADC则定位在细胞核。(4)qRT-PCR分析显示,休眠期间‘G6-罗亚理’花芽中PavPAO5的表达量低于‘Mazzard-罗亚理’,而PavADC的表达量高于‘Mazzard-罗亚理’;在整个休眠期,PavPAO2和PavPAO4的表达量整体水平远远低于PavPAO5,推测PavPAO5可能是在休眠期起主导作用的家族成员。(5)BiFC验证结果表明,在多胺代谢过程中PavADC与PavSAMDC存在互作关系,推测两者相互作用参与调控花芽内多胺水平。研究认为,甜樱桃砧木类型能够通过影响多胺代谢进程而影响休眠以及开花的进程,关键基因PavPAOs和PavADC的高表达能够影响花芽内多胺水平,PavADC能够使多胺含量升高从而促进休眠解除以及提早开花;多胺代谢过程中关键基因的表达和多胺含量变化能够影响休眠和花期,多胺含量的升高能够促进休眠解除以及提早开花。     

番茄转化酶抑制子基因克隆及其表达分析

从普通栽培型番茄品种‘桃太郎’、野生醋栗番茄和潘那利番茄的幼苗中采用RT-PCR方法,扩增出转化酶抑制子基因cDNA序列的部分片段。经测序表明：不同基因型番茄的转化酶抑制子基因同源性高达97.97%以上。采用半定量RT-PCR方法对‘桃太郎’苗期根、茎、叶和花后功能叶、花期子房以及果实不同发育阶段不同部位的表达进行检测,结果表明：INH在根中表达较弱,茎中有强烈表达,从幼叶到衰老叶表达逐渐减弱;同一时期INH在果肉中表达相对较强,维管束次之,胶质胎座相对较弱;花期子房中INH的表达逐渐增强,花后3d左右达到最大,花后5～8d表达量迅速下降。     

砀山酥梨多酚氧化酶基因(PbPPO)的原核表达及优化研究

从砀山酥梨Pyrus bretschneideri ‘Dangshan Su’果实中克隆得到一条多酚氧化酶基因(PbPPO)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JF809859)。通过生物信息学分析表明,PbPPO基因CDS区全长1782 bp,编码593个氨基酸,氨基酸序列由N端叶绿体转运肽、Cu结合区与C端疏水区三部分组成。为进一步研究Pb PPO基因的功能,成功构建其原核表达载体pET-28a-PbPPO,并在大肠杆菌Rosetta菌株中成功诱导表达,经优化后显示,在28℃、1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h的条件下,融合蛋白表达量最高。     

砧木对梨叶芽休眠的影响及其与多胺代谢的关系

以分别嫁接在杜梨和豆梨上的砂梨品种‘丰水’为试材,研究了2008和2009年11～12月气温变化和不同砧木对‘丰水’梨叶芽休眠进程的影响,分析叶芽中游离态和束缚态内源多胺种类和含量的变化,结果表明：嫁接在豆梨上的‘丰水’叶芽自然休眠结束的时间要比嫁接在杜梨上的‘丰水’叶芽早10d左右,且游离态和束缚态腐胺（Put）、戊二胺（Cad）、己二胺（Hex）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）5种内源多胺含量开始升高的时间与供试材料叶芽自然休眠结束的时间一致,表明梨叶芽的休眠进程与砧木种类和多胺代谢有密切关系,尤其是与束缚态多胺含量变化的关系更为密切。     

桃树体不同部位果实着色差异及其与环境因子的关系研究

为探讨树体冠层不同部位桃果实着色机制差异及其与环境因子的关系,以晚熟桃品种‘霞晖8号’为试材,研究了果实3个典型发育时期(硬核期、膨大期、成熟期)树体冠层上部、中部外围、中部内膛和下部的温度、光照环境因子变化动态,并就其对果皮色泽、色素含量的影响及与果实着色相关的基因表达特点进行解析。结果表明:(1)与冠层下部果实相比,‘霞晖8号’冠层上部、中部外围和中部内膛成熟果实果皮a~*/b~*(红色饱和度/黄色饱和度)显著较高。(2)冠层下部成熟果实的果皮花色素苷含量最低而叶绿素含量最高,且与其他部位间差异显著。(3)果实不同发育时期花色素苷合成相关基因的表达量差异表明,果皮花色素苷合成是多基因协同调控的过程。(4)果实转色前,低光照强度抑制了花色素苷合成相关基因的表达,其中对UFGT、DFR、CHS基因的调控作用最明显;果实成熟期,与高光照条件相比,低光照条件下果皮花色素苷合成相关基因上调表达。研究认为,树体冠层不同部位光照条件差异可能是导致果实着色差异的主要环境因素之一,它通过调节与果皮花色素苷积累相关的基因表达水平控制果皮的着色。     

石榴木质素合成相关基因PgMYB308的克隆和表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatumcv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,获得与木质素的合成相关基因PgMYB308。PgMYB308基因cDNA全长792bp,编码263个氨基酸。分子量为29.56kD,理论等电点为9.07。序列比对和功能域分析发现,PgMYB308包含R2和R3保守域,以及C1、C2、C4和锌指基序。系统进化树分析显示,PgMYB308与其他物种起源相同,而与桉树EgMYB308亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,PgMYB308在茎、叶和种子等组织中均有表达,其中茎中表达量最高,叶片中表达量最低;PgMYB308在‘突尼斯软籽’中表达最高,而在‘红玉石籽’和‘白玉石籽’中表达量较低;PgMYB308在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达,但在花后20d相对表达量最高,以后随发育进程呈现逐渐下降的趋势。     

宁夏枸杞果实生长发育期内源激素变化及关系研究

以‘宁杞1号’枸杞为材料,采用高效液相色谱技术,对不同发育时期宁夏枸杞果皮和种子内源激素(ZT、GA3、IAA、ABA)含量进行测定,以揭示其变化规律.结果显示:(1)种子中的生长素与果实横径和果实单粒重均呈极显著的正相关关系,与果实纵径呈显著正相关关系,即种子中的生长素在果实的增大中起着重要的作用.(2)果皮和种子中的赤霉酸含量都远远大于其他3种激素含量,且从第一次快速生长期(花后2～8 d)到缓慢生长期(花后8～25 d),其含量与种子中的生长素含量变化较为一致,进入第二次快速增长期(花后25～33 d)以后,果皮和种子中赤霉酸的含量则迅速下降,而种子中的生长素含量却急速上升,这可能是果皮和种子中的赤霉酸促进了种子内生长素的合成,而种子内的生长素可以直接调节果实细胞的伸长.研究表明,‘宁杞1号’种子中的内源激素在果实生长发育中起着重要的作用,且各激素间存在着平衡关系,果皮和种子中各种激素相互影响,共同促进果实的生长发育.     

不同红梨果皮类黄酮合成基因表达模式分析

采用半定量和荧光定量PCR方法,分析10个类黄酮合成基因在梨品种‘红星’和‘满天红’成熟果皮中的转录特性以及光照对基因表达的影响.结果表明:‘满天红’花色苷合成上游基因(CHS、CHI)的表达量高于‘红星',而下游基因(F3H、DFR、ANS)以及黄酮醇(FLS)和原花色素(LAR、ANR)合成相关基因的表达量却正好相反.套袋去除光照可使所有被检测基因的转录水平降低,F3GT和FLS最明显,表达量差异达20～30倍以上,且套袋‘红星’中PAL、F3H、DFR、ANS、LAR、ANR基因的表达量仍高于不套袋‘满天红’.研究认为,花色苷合成下游基因转录水平的差异是2个红色梨品种间着色不同的主要原因,而F3GT是光照调控‘红星’着色的关键基因.     

多胺对菊花激素含量与花芽分化的影响

以切花菊（Dendranthema morifolium）品种‘神马’为试材,外源喷施0．1mmol·L-1的亚精胺（Spd）与多胺合成抑制剂D-精氨酸（D．Arg）,转入昼10h／夜14h的短日条件下进行开花诱导,测定不同花芽分化时期顶芽内源多胺[腐胺（Put）、亚精胺（Spd）、精胺（spm）]和几种激素[生长素（IAA）、玉米素核苷（ZR）、异戊烯基腺苷（iPA）、赤霉素（GA）]含量的动态变化,分析多胺对激素和花芽分化的作用关系。结果表明,外源多胺和多胺合成抑制剂能够显著影响顶芽内源多胺（Put、Spd、Spm）和激素（IAA、ZR、iPA、GA）的含量,顶芽内高水平多胺有利于菊花花芽分化的启动和保持;外源多胺及多胺合成抑制剂可能通过影响内源多胺含量从而影响内源激素或者直接影响内源激素和内源多胺,进而调控花芽分化：内源Put与IAA关系密切,高水平的内源Put不利于IAA的积累;ZR和iPA含量与内源多胺总量的变化趋势一致;外源多胺及多胺合成抑制剂对GA的影响主要在花序分化期和小花分化期,且高水平的内源Spd和Put不利于GA的积累。