葡萄半不育花粉粒形态和细胞学观察及相关基因表达分析

以葡萄品种‘魏可’(可育)及其自交后代单株‘魏可实生-3’和‘魏可实生-12’以及品种‘钟山红’(雄性不育)为材料,对花器官特征、花粉萌发率、花粉粒形态以及小孢子发育过程的细胞学特征进行观察,并对绒毡层发育相关基因(DYT1、TDF1和MYB4)的表达进行分析,以初步鉴定葡萄半不育单株的不育特征,揭示花粉败育与基因调控的关系。结果显示:(1)‘魏可实生-3’和‘魏可实生-12’的花粉萌发率均在10%左右,属于半不育花粉;其雄蕊主要特征为花丝卷曲,花丝短于花柱,花药内花粉量少,花药中既有正常长球形花粉粒也有异常近球形花粉粒。(2)‘魏可实生-3’、‘魏可实生-12’没有明显的药室壁结构,小孢子母细胞稀少、疏松;‘魏可实生-3’双核期绒毡层未完全降解,绒毡层细胞中的营养物质滞留没有及时供应小孢子的发育,致后期部分小孢子败育;‘魏可实生-12’绒毡层细胞在单核早期就大部分降解而导致营养供应异常,使部分小孢子败育。(3)在减数分裂期,‘魏可’的绒毡层发育相关基因DYT1和TDF1的表达均最高,MYB4最低,‘钟山红’的3个基因的表达与‘魏可’相反,‘魏可实生-3’和‘魏可实生-12’的表达水平均在‘魏可’与‘钟山红’之间;单核早期以后,3个基因在‘魏可’的表达一直均较低,钟山红’的DYT1基因表达一直最高,其余2个基因均在最低水平,而‘魏可实生-3’的TDF1、MYB4基因在单核早期表达量最高,‘魏可实生-12’的TDF1在双核期表达量最高。研究表明,‘魏可实生-3’的花粉败育发生在单核晚期至双核期,‘魏可实生-12’的花粉败育发生在单核早期;部分药室绒毡层的异常降解,小孢子发育营养供应不均衡可能是导致其花粉半不育发生的原因;‘魏可实生-3’的绒毡层延迟降解与减数分裂期DYT1基因的表达量不足、单核期TDF1基因的过量表达以及MYB4基因在单核期的异常表达有关,而‘魏可实生-12’的绒毡层提前降解与减数分裂期DYT1基因的表达量不足而MYB4基因过量表达,以及双核期TDF1基因过量表达有关。     

根域限制对葡萄根中IAA含量及其代谢相关基因表达的影响

以1年生“玫瑰香”葡萄为试验材料,进行根域限制栽培处理,以传统地栽为对照,研究根域限制对葡萄根系构型、细胞结构、IAA含量及其代谢和根系生长发育相关基因表达丰度的影响,以探讨根域限制栽培影响葡萄根系构型变化的内在机制。结果表明:(1)根域限制处理后,葡萄根系构型发生显著变化,主要表现在根尖处出现大量集群根、不定根持续发生、根系出现螺旋卷曲;根系细胞排列更加疏松,幼根根尖的根冠区更厚,细胞更大、更长;毛细根的内皮层细胞加厚,中柱鞘和皮层细胞更大。(2)根域限制处理显著降低了葡萄根中IAA的含量;在葡萄定植后40、100和205 d时,根系IAA合成关键基因VvYUC6和VvYUC8的表达量变化趋势与IAA含量变化趋势一致,同时根域限制处理诱导IAA合成相关基因VvTAR2、VvYUC2和VvYUC4的表达水平在大部分采样时期显著上调;在定植后70、85、130和205 d时,根域限制导致VvAUX1、VvLAX1等8个IAA运输相关基因的表达水平显著上调,这与根域限制下根系大量发生的时期相吻合。(3)根域限制条件下,葡萄细胞周期调控相关基因VvcycA1、VvcycB1、VvcycD3和Vvcdc2在8月中旬到11月初呈上调表达趋势。研究表明,根域限制下葡萄根系构型、细胞结构以及内源IAA均发生显著变化;根域限制可能通过改变根系中生长素合成和极性运输相关基因的表达丰度,从而影响根系中生长素的合成和运输,进而改变葡萄的根系构型以适应根域限制的栽培环境。     

砧木类型对甜樱桃花芽多胺代谢相关基因表达和休眠的影响

为验证砧木类型对甜樱桃多胺代谢和花芽休眠的影响,该研究以嫁接于不同砧木——矮化砧木‘吉塞拉6号’[Gisela 6,(G6)]和乔化砧木‘马扎德’(Mazzard)的甜樱桃品种‘罗亚理’为试材,通过田间观察确定嫁接于两种砧木的‘罗亚理’休眠期和花期,利用生物信息学、基因克隆、实时荧光定量、亚细胞定位和双分子荧光互补等手段,对甜樱桃花芽内多胺代谢中关键基因[多胺氧化酶基因(PavPAOs)和精氨酸脱羧酶基因(PavADC)]进行克隆和功能分析,对可能与PavADC存在互作关系的蛋白进行预测和验证,并利用高效液相色谱法对花芽内游离多胺的含量进行测定。结果表明:(1)‘Mazzard-罗亚理’的休眠期(75 d)长于‘G6-罗亚理’(69 d),且初花期晚于‘G6-罗亚理’。(2)‘G6-罗亚理’花芽内游离多胺含量高于‘Mazzard-罗亚理’,其中Put含量高1.2%~163.4%,Spd含量高8.8%~261.1%,Spm仅在1月和3月的‘G6-罗亚理’花芽中检测到。(3)成功克隆获得甜樱桃多胺代谢关键基因PavPAO2、PavPAO4、PavPAO5和PavADC,其长度分别为1485、1611、1704和2307 bp;系统进化分析表明,甜樱桃PavPAOs和PavADC均与桃、扁桃和苹果等物种的亲缘关系较近;亚细胞定位显示,PavPAO2和PavPAO4定位在细胞膜,而PavPAO5和PavADC则定位在细胞核。(4)qRT-PCR分析显示,休眠期间‘G6-罗亚理’花芽中PavPAO5的表达量低于‘Mazzard-罗亚理’,而PavADC的表达量高于‘Mazzard-罗亚理’;在整个休眠期,PavPAO2和PavPAO4的表达量整体水平远远低于PavPAO5,推测PavPAO5可能是在休眠期起主导作用的家族成员。(5)BiFC验证结果表明,在多胺代谢过程中PavADC与PavSAMDC存在互作关系,推测两者相互作用参与调控花芽内多胺水平。研究认为,甜樱桃砧木类型能够通过影响多胺代谢进程而影响休眠以及开花的进程,关键基因PavPAOs和PavADC的高表达能够影响花芽内多胺水平,PavADC能够使多胺含量升高从而促进休眠解除以及提早开花;多胺代谢过程中关键基因的表达和多胺含量变化能够影响休眠和花期,多胺含量的升高能够促进休眠解除以及提早开花。     

葡萄雄性不育基因的初步定位

为了对葡萄雄性不育基因进行定位研究,以可育葡萄‘魏可’(Vitis vinifera L.)为亲本构建的自交群体88株为试验材料,运用分离群体分组混合分析法(bulked segregant analysis,BSA),构建了可育株和不育株基因池,结合SSR技术对葡萄雄性不育基因进行定位研究和生物信息学分析。该研究筛选到2个与葡萄雄性不育基因连锁的SSR标记VVMD34和VVIB23,且位于该基因两侧,遗传距离分别为3.5cM和1.9cM。2个标记间物理距离为1 134kb,在该区域总共预测到了111个候选基因。该研究对葡萄雄性不育基因的精细定位及分子标记辅助育种奠定了良好的基础。