石榴木质素合成相关基因PgMYB308的克隆和表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatumcv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,获得与木质素的合成相关基因PgMYB308。PgMYB308基因cDNA全长792bp,编码263个氨基酸。分子量为29.56kD,理论等电点为9.07。序列比对和功能域分析发现,PgMYB308包含R2和R3保守域,以及C1、C2、C4和锌指基序。系统进化树分析显示,PgMYB308与其他物种起源相同,而与桉树EgMYB308亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,PgMYB308在茎、叶和种子等组织中均有表达,其中茎中表达量最高,叶片中表达量最低;PgMYB308在‘突尼斯软籽’中表达最高,而在‘红玉石籽’和‘白玉石籽’中表达量较低;PgMYB308在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达,但在花后20d相对表达量最高,以后随发育进程呈现逐渐下降的趋势。     

光皮桦中4-香豆酸辅酶A连接酶基因Bl4CL的克隆和表达分析

以从光皮桦茎叶组织提取的mRNA为模板,根据其他已克隆到的阔叶类树种中4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因的同源序列设计兼并引物,进行RT-PCR扩增,获得部分基因片段,然后结合5’,3’RACE方法从光皮桦中扩增出1个4CL基因的全长cDNA序列,命名为Bl4CL。该基因cDNA全长为1983bp(GenBank登录号FJ410448),具有完整的开放阅读框架(69～1697bp),编码蛋白为542个氨基酸,包含一个AMP结合功能域和一个含有12个氨基酸的功能基序。与其他植物中的4CL进行同源性比对的结果显示,Bl4CL蛋白与东北白桦的同源性最高,达到了98%。该基因在光皮桦的根和茎中表达量较高,而在花和叶中的表达量低。     

光皮桦中4-香豆酸辅酶A连接酶基因B14CL的克隆和表达分析

以从光皮桦茎叶组织提取的mRNA为模板,根据其他已克隆到的阔叶类树种中4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）基因的同源序列设计兼并引物,进行RT—PCR扩增,获得部分基因片段,然后结合5’,3’RACE方法从光皮桦中扩增出1个4CL基因的全长cDNA序列,命名为B14CL。该基因cDNA全长为1983bp（GenBank登录号FJ410448）,具有完整的开放阅读框架（69—1697bp）,编码蛋白为542个氨基酸,包含一个AMP结合功能域和一个含有12个氨基酸的功能基序。与其他植物中的4CL进行同源性比对的结果显示,B14CL蛋白与东北白桦的同源性最高,达到了98％。该基因在光皮桦的根和茎中表达量较高,而在花和叶中的表达量低。     

棉花4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

本研究从棉花中克隆了一个4CL基因,命名为Gh4CL2(GenBank登录号为FJ848870)。研究结果表明:Gh4CL2基因cDNA全长2332bp,具有一个1725bp的开放阅读框,5′非编码区为64bp,3′非编码区为543bp,编码574个氨基酸,预测分子量约为62.106kD,等电点为5.94。氨基酸同源性分析发现,Gh4CL2与来自白杨、大豆和紫草的4CL一致性较高。进一步研究Gh4CL2基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-4CL2,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,最佳诱导表达条件为0.5mmol/LIPTG在37℃下诱导4h,重组蛋白主要以包涵体形式出现。     

甘薯4-香豆酸辅酶A连接酶基因的生物信息学鉴定和表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase, 4CL)在苯丙烷类代谢途径中具有重要调控作用。该研究利用转录组数据在甘薯品种QS48中鉴定了11个4CL基因,并将这些基因命名为Ib4CL1～Ib4CL11。序列比对和功能域分析发现, 11个Ib4CL蛋白均具有典型的4CL结构特征,包含保守的BoxⅠ和BoxⅡ的结构域。进化和保守基序分析显示,Ib4CL1和Ib4CL2属于Ⅰ类4CL,Ib4CL3属于Ⅱ类4CL,而Ib4CL4～Ib4CL11属于4CL类似蛋白。转录组数据和荧光定量PCR分析显示,Ib4CL3和Ib4CL10在甘薯QS48的叶中转录表达水平显著高于茎和块根,与绿原酸的积累呈正相关关系;Ib4CL4和Ib4CL8在嫩叶中表达较高,与花青素的积累密切相关。研究结果为进一步揭示甘薯4CL基因在苯丙烷类代谢途径中的功能奠定了基础。     

云杉NBS-LRR基因的克隆与表达分析

为深入研究NBS-LRR基因在川西云杉(Picea balfouriana)抗落针病过程中的分子作用机制,该研究根据GenBank数据库中其他植物NBS-LRR基因保守序列设计引物,利用RT-PCR技术,克隆云杉NBS-LRR基因全长cDNA序列(PbNBS-LRR),分析该基因及其编码蛋白的相关信息并进行基因表达研究。结果表明:(1)成功获得PbNBS-LRR基因的全长2 616 bp(基因登录号:MK044348),且包含一个2 508 bp的完整阅读框(ORF),共编码836个氨基酸,其氨基酸序列具有NBS-LRR类抗病基因典型的NB-ARC结构域和LRR结构域。(2)云杉PbNBS-LRR与北美云杉(Picea sitchensis)NBS-LRR类抗病蛋白相似性最高,达到98%;分子进化分析进一步表明,PbNBS-LRR与北美云杉NBS-LRR亲缘关系最近,其次为糖松(Pinus lambertiana)和火炬松(Pinus taeda)。(3)qRT-PCR分析表明,NBS-LRR基因在川西云杉、粗枝云杉(Picea asperata)和丽江云杉(Picea likiangensis)的根、树干韧皮部、嫩枝及针叶中均有表达,在川西云杉和粗枝云杉的根部以及丽江云杉的树干韧皮部中表达量最高;在落针病病原菌侵染川西云杉和粗枝云杉的初期(5月)以及丽江云杉的后期(9月),NBS-LRR基因的表达量最高,分别为对照的1.73倍、2.11倍和90.49倍,表明NBS-LRR基因参与了云杉落针病的防御反应。     

梅花2个SVP基因的克隆与表达分析

SVP (SHORT VEGETATIVE PHASE)是MADS box家族一员,它能够整合多条开花途径的开花信号,调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)成花转变过程的分子机理,该研究采用RT PCR方法从梅花‘长蕊绿萼’中克隆到2个SVP的同源基因,分别命名为PmSVP1和PmSVP2,并采用荧光定量PCR对2个基因的表达模式进行分析。序列分析表明,PmSVP1和PmSVP2的编码区长度分别为687 和672 bp,分别编码228和223氨基酸。系统进化结果显示,PmSVP1与拟南芥AtSVP以及一些木本植物SVP同源基因聚为一组,PmSVP2与马铃薯、乳浆大戟等草本植物中的SVP同源基因聚为一组。实时荧光定量分析表明,在成年梅花中,2个PmSVP基因主要在茎、叶和叶芽等营养器官中表达,且都在叶中表达量最高。在1月龄幼苗中,PmSVP1基因在根、茎、叶中都有表达,PmSVP2基因则没有任何表达;在梅花花芽分化过程中,PmSVP1和PmSVP2基因的表达量均呈现下调表达的趋势。研究推测,PmSVP1和PmSVP2基因可能参与调控梅花从营养生长向生殖生长的转变。     

百合LbKCS5和LbKCS17基因的克隆与表达分析

β 酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)是超长饱和脂肪酸链(VLCFAs)生物合成中的限速酶,该研究以百合(Lilium brownii var. viridulum Baker.)‘黄天霸’cDNA为模版, 采用RT PCR方法克隆了LbKCS5和LbKCS17基因的CDS序列,并进行序列分析,采用qRT PCR方法分析其基因表达以及胁迫诱导特征。结果表明：(1)LbKCS5和LbKCS17分别包含689和1 238 bp完全阅读框(ORF), 编码186和291个氨基酸;进化分析显示, LbKCS5与油棕KCS5、LbKCS17与莲KCS17序列相似性最高,分别为82.61%和77.62%。(2)基因表达分析结果显示, LbKCS5和LbKCS17 在百合营养器官中均有表达,二者在叶中表达量最高,在根中最少;在花器官中,LbKCS5的表达量在雄蕊中最高,LbKCS17在花药中最高,在花瓣中二者的表达量最低;在花蕾生长发育过程中,花瓣中2个基因的表达均先升高后下降,并于黄蕾期达到峰值;叶中LbKCS5表达量在黄蕾期达到最高,而LbKCS17在叶中的表达整体较低。(3)失水胁迫能提高这2个基因的转录表达,低温诱导LbKCS5表达量的增加,但却降低了LbKCS17的表达。研究表明,LbKCS5和LbKCS17在百合不同器官中均有表达,且均响应失水和低温胁迫,这为研究百合耐失水和低温胁迫以及新品种选育提供了理论支持。     

百合LbCAT和LbGPX基因的克隆与表达分析

以切花百合(Lilium brownii var. viridulum)‘卡瓦纳’cDNA为模板,克隆了过氧化氢酶(LbCAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(LbGPX)基因。序列分析表明,这2个基因分别包含1 479 bp和519 bp的开放阅读框(ORF),编码492个和172个氨基酸。进化分析结果表明,LbCAT蛋白与岷江百合CAT蛋白的氨基酸序列相似性最高(99.19%),且亲缘关系最近;LbGPX蛋白与油棕GPX蛋白的氨基酸序列相似性最高(78.61%),亲缘关系最近。qRT PCR结果显示,LbCAT和LbGPX在百合根、鳞茎、叶和花中都有表达。LbCAT在叶中表达量最高,LbGPX在花中表达量最高。这2个基因在百合花蕾的生长发育过程中均有表达,且表达量逐渐增加;在PEG处理后2个基因的转录水平升高,但独角金内酯(SLs)处理却显著降低了这2个基因的转录水平;该结果为百合抗逆性机理研究以及抗逆育种奠定了基础。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。     

石榴赤霉素合成相关基因PgKO的克隆及表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatum cv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术,从石榴花中克隆得到赤霉素合成关键酶——内根贝壳杉烯氧化酶(KO)基因,命名为PgKO(GenBank登录号为MG208017)。PgKO全长cDNA为1 729bp,包含1 542bp开放阅读框(ORF),编码513个氨基酸,相对分子量为141.16kD,理论等电点为4.9。多重序列对比显示,PgKO与苹果MdKO、白梨PcKO、葡萄VvKO的相似性分别为61.28%、64.56%和73%,并且具有CYP450结构域(脯氨酸富含域、氧还原位点和血红素结合域)。系统进化树分析表明,PgKO与其他物种的起源相同,并与桉树EgKO的亲缘关系最近。荧光定量PCR发现,在石榴蕾期和盛花期,PgKO基因的表达量均为筒状花高于钟状花,且PgKO基因在两种花型的子房、花药、花萼中均有表达,但筒状花中子房的表达量最高,花萼的表达量最低;钟状花中花药的表达量最高,子房的表达量最低。     

中间锦鸡儿CiMYB68基因克隆及表达分析

该研究以中间锦鸡儿(Caragana intermedia)为材料,利用RACE技术克隆了CiMYB68基因的全长序列。对CiMYB68的基因组DNA和cDNA全长分析显示,CiMYB68基因无内含子,开放阅读框为852bp,编码284个氨基酸。预测CiMYB68基因编码的蛋白质等电点为8.95,分子量约为31 459.4Da。序列比对和系统进化分析表明,该蛋白和大豆的GmMYB68一致性最高,达到67%。构建了CiMYB68基因与GFP融合表达质粒,激光共聚焦显微镜观察发现,融合蛋白定位于细胞核。用实时荧光定量PCR技术对在不同胁迫条件下CiMYB68基因的表达检测结果表明,在干旱和低温处理下CiMYB68均受到不同程度的诱导,暗示CiMYB68基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

家蚕分泌型磷脂酶A2基因的鉴定和表达模式分析

磷脂酶A2 (phospholipase A2, PLA2)广泛分布于动物、植物和微生物,参与许多生理活动。本实验室先前鉴定和研究了1个家蚕分泌型PLA2 (Bombyx mori sPLA2-1-1)基因功能。最近,从家蚕基因组鉴定到4个新的sPLA2基因(BmsPLA2-1-2、BmsPLA2-2、BmsPLA2-3、BmsPLA2-4),预测的氨基酸都具有sPLA2超家族结构域、金属离子结合位点和高度保守的催化位点等sPLA2的典型特征。本研究完成了BmsPLA2-4基因的克隆、体外表达和表达模式分析。BmsPLA2-4全长为585 bp,体外表达经Ni纯化获得重组蛋白大小约25 kDa。qRT-PCR分析表明,BmsPLA2-4在5龄第1天的表达量最高。组织表达谱分析表明,BmsPLA2-4在中肠的表达量最高,其次是体壁和脂肪体。Western blotting分析结果与qRT-PCR一致。用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染5龄第1天幼虫后,BmsPLA2-4基因的表达量在24 h显著升高。本研究为后续研究提供了理论基础和有价值的实验数据。     

旱麦草 EtAP2基因的克隆及其对干旱胁迫的响应表达

以旱麦草(Eremopyrum triticeum)为实验材料,利用RT-PCR技术从旱麦草叶片中克隆了1个AP2/ERF家族基因,命名为EtAP2(GenBank登录号KX622583)。EtAP2基因含有1 128bp开放阅读框,编码375个氨基酸,相对分子质量40.87kD,等电点为5.36。多序列比对和进化树分析表明,该基因编码蛋白具有2个AP2保守结构域,与小麦AP2/ERF家族蛋白具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析表明,15%PEG 6000模拟干旱胁迫可诱导EtAP2基因在根和叶中表达,且在根中对干旱胁迫的响应大于叶片。研究表明,EtAP2可能参与旱麦草对干旱逆境胁迫应答的调节。     

草莓生长素响应因子FvARF10和FvARF18基因的克隆及表达分析

该研究以森林草莓(Fragaria vesca)为试验材料,利用RT-PCR技术克隆草莓FvARF10、FvARF18基因全长cDNA序列。生物信息学分析表明,FvARF10、FvARF18基因开放阅读框(ORF)分别为2 056bp和2 100bp,编码685和699个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为75.73、76.78kD和8.12、6.55。系统进化树分析表明,FvARF10与苎麻BnARF10聚为一个分支,FvARF18与桑树MnARF18聚集在一个分支上,进化关系较密切。亚细胞定位预测分析表明,FvARF10、FvARF18蛋白均定位于细胞核或细胞质中。启动子分析显示,FvARF10、FvARF18基因均具有多样化的激素应答元件。荧光定量PCR结果显示,FvARF10和FvARF18基因在草莓不同组织中均有表达,FvARF10在果实中表达较高,且在半熟果中表达量最高,而FvARF18在茎中相对表达量最高;外源激素IAA处理1h后,FvARF10和FvARF18基因受到强烈诱导均呈上调表达,而后渐恢复正常水平。研究结果表明,FvARF10和FvARF18基因可能参与草莓的营养生殖及果实的生长发育调控,且与生长素信号转导过程相关。     

小立碗藓PpAGO7基因的克隆及表达分析

该研究采用同源克隆的方法获得了小立碗藓AGO7蛋白编码基因PpAGO7,对PpAGO7基因序列特征进行生物信息学分析,并利用Real-time PCR方法分析PpAGO7基因的时空表达模式,为揭示小立碗藓中PpAGO7基因的生物学功能提供依据。结果表明:PpAGO7基因的全长cNDA为3 583bp,其中开放阅读框3 363bp,编码1 120个氨基酸,分子量123.38kD,等电点9.26,含有AGO蛋白典型的PAZ和PIWI结构域;PpAGO7基因在小立碗藓整个生活周期都有表达,且在茎叶体生长时期表达水平较高,但在原丝体时期表达水平较低。研究结果推测PpAGO7基因可能在茎叶体拟叶的生长发育过程中起作用。     

牛樟芝倍半萜合酶基因克隆及在不同培养基中的表达

牛樟芝(Antrodia camphorata)是一种珍稀食药用菌,能产生具有抗癌活性的倍半萜类化合物。对牛樟芝基因组进行分析,获得倍半萜合酶基因序列并设计特异引物,提取在Glu培养基(麦芽浸粉6 g/L,酵母提取物3 g/L,葡萄糖40 g/L)上生长的牛樟芝菌丝体的RNA,利用RT-PCR技术克隆得到倍半萜合酶基因AcTPS1。AcTPS1基因c DNA全长为969 bp,编码323个氨基酸,根据系统进化树可知AcTPS1氨基酸序列与其他9种真菌倍半萜合酶聚为一类。AcTPS1拥有典型倍半萜合酶的结构域(RRSRSATAEAYACFIW),之后检测AcTPS1在不同培养基上的菌丝中的表达结果显示不同碳源中,只有葡萄糖作为碳源时该基因表达,不同氮源中,以番茄浸粉和酪蛋白胨为氮源时该基因表达。说明AcTPS1是一类诱导型表达的基因。为利用发酵培养以及异源表达手段获得牛樟芝活性化合物提供参考。