三氟拉嗪通过诱导p16INK4a抑制BGC-823细胞增殖

为探索三氟拉嗪（trifluoperazine, TFP）抗肿瘤作用机制,对胃癌BGC-823细胞进 行TFP（5、10 μmol/L）处理后,利用计数法、BrdU脉冲标记法、Western印迹等方法从细胞形态、细胞增殖、S期细胞百分比以及相关因子表达水平等方面进行分析. 结果显示,TFP处理后,细胞形态发生明显改变,细胞增殖受到明显抑制且呈时间计量 效应关系;S期细胞比例下降;p16INK4a表达水平升高.为进一步研究TFP诱导 p16INK4a表达的分子机制,本实验采用插入p16INK4a启动子片段及荧光素酶报告系统 的载体pGL3-Basic-p16INK4a（-967~-165 bp）,研究了TFP在转录水平对p16INK4a启 动子活性的影响.结果表明, TFP能够提高p16INK4a的启动子活性.上述结果提示,TFP 通过诱导p16INK4a表达抑制BGC-823细胞增殖.     

抑癌蛋白p16INK4a:一种新的衰老调控因子

p16INK4a是一种非常重要的抑癌蛋白．可通过抑制癌细胞的分裂和诱导癌细胞的死亡而减少癌症的发生,因此它的缺失或异常将增加患癌症的概率。最新的研究却发现,p16INK4a还有另外一个重要作用,通过诱发老龄哺乳动物干细胞功能下降而促使衰老的产生．至少在骨髓、前脑、胰岛细胞和角化细胞等类型细胞中被证实。这个发现使人们对p16INK4a功能和衰老分子机制有了新的理解,因此为更好的临床应用提供了重要的材料。     

EB病毒感染人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程中抑制p16INK4a表达

细胞周期调控紊乱是细胞永生化进程中一个重要的分子事件,本文利用Western blotting和S-P法分别检测p16~(INK4a)、p53、p21~(WAF1/CIP1)和E2F1的蛋白表达,试图从细胞周期调控的角度,探讨EB病毒诱导人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期的分子机制。结果表明,EB病毒通过抑制p16~(INK4a)表达而阻断p16~(INK4a)/Rb途径,上调转录因子E2F1,而对p53、p21~(WAF1/CIP1)表达无明显的影响。结果初步揭示,EB病毒介导的p16~(INK4a)/Rb/E2F1细胞周期调控紊乱参与了人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程,为进一步探讨鼻咽癌发病机制提供了科学依据。     

P14ARF对人黑色素瘤细胞增殖的影响及其作用机理的初探

ARF(alternative reading frame)作为INK4a/ARF的β转录产物,能够稳定p53,诱导细胞周期阻断或凋亡.利用高表达p14ARF的人黑色素瘤细胞模型,探讨了ARF抑制细胞增殖的分子作用机理.研究发现p14ARF高表达能将细胞周期阻断在G1和G2期,p53,p2lcipl和p27kipl蛋白水平明显增强,而p-ERK1/2,CyclinDl和CyclinE蛋白水平下降,明显抑制细胞生长.提示p14ARF能通过ERK(extracellular signal-regulated kinase)信号通路相互协调作用抑制A375细胞增殖.     

ING1家族各异构体抑制HeLa细胞增殖的分子机制研究

ING1(inhibitor of growth 1)是一个候选抑癌基因家族,p47ING1a、p33ING1b和p24ING1c是其三种剪接异构体.通过MTT法和流式细胞术研究ING1a、ING1b和ING1c对HeLa细胞增殖的影响,结果发现三者均可将HeLa细胞阻滞于G0/G1期并抑制细胞生长.采用PCR方法构建ING1a和ING1b的PHD结构域缺失体1aΔC和1bΔC,进而使ING1a,ING1b、ING1c、1aΔC和1bΔC在HeLa细胞中过表达.采用Western blot检测上述HeLa细胞中p16INK4a、PTEN/p27Kip1和p53/p21Waf1的表达变化,结果发现ING1a、ING1b、ING1c和1aΔC均可促进p16INK4a的表达,其中ING1c的促进作用最为显著,1bΔC则略微抑制了p16INK4a的蛋白质表达.利用荧光素酶分析初步确定1aΔC可增强p16INK4a启动子活性而促进p16INK4a的转录,1bΔC则抑制了p16INK4a启动子活性.上述结果阐释了ING1家族各成员对HeLa细胞增殖的影响及其分子机制,从而确定了各异构体功能的异同及它们所调控的重要基因.首次发现除p53/p21Waf1通路外,ING1家族各异构体还可通过上调p16INK4a和PTEN的表达而抑制肿瘤细胞生长,并且ING1a的PHD结构域删除体可以增强p16INK4a的转录,这为研究ING1家族抑制肿瘤细胞生长的分子机制提供了新的线索.     

p16INK4a在早孕小鼠子宫内膜的表达及其对胚泡着床的影响

本研究旨在检测肿瘤抑制基因p16INK4a(inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a)在早孕小鼠子宫内膜中的表达规律,探讨p16INK4a在小鼠胚胎着床过程中的作用.采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和免疫组织化学方法分别检测未孕小鼠及孕小鼠第2、3、4、5、7天子宫内膜p16INK4a mRNA和蛋白的表达;子宫角注射p16INK4a抗体观察胚泡着床数.FQ-PCR结果显示孕小鼠子宫内膜组织p16INK4amRNA的表达高于未孕小鼠,且随着妊娠天数的增加呈现表达逐渐增强的趋势,到妊娠第5天达到最高,后渐降.免疫组织化学分析显示p16INK4a蛋白在子宫内膜的表达规律与mRNA结果一致.子宫角注射p16INK4a抗体后胚泡着床数明显减少.以上结果提示,P161INK4a在妊娠早期子宫内膜持续表达,可能参与胚泡着床.     

小鼠胚胎干细胞p16INK4a基因外显子1α打靶研究

在活体水平上 ,小鼠p16 INK4a基因是否具有抑制肿瘤发生和发展的功能是一个悬而未决的问题。利用筛选基因组文库得到的小鼠p16 INK4a基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠p16 INK4a 基因外显子 1α的基因打靶载体 ,其短臂为1.5kbEco81Ⅰ AccⅡ片段 ,长臂为 5 .9kbXbaⅠ XhoⅠ片段。打靶载体经线性化和纯化后通过电穿孔转导小鼠R1ES细胞 ,获得 37个G418和Gancyclovir双药抗性克隆。用Southern杂交法对双药抗性克隆进行鉴定 ,获得一个敲除了p16 INK4a基因外显子 1α的阳性ES细胞克隆。     

人参皂甙Rg1对体外人胃癌细胞增殖的抑制作用及机制

本研究用不同浓度人参皂甙Rg1作用人胃癌BGC-823细胞24 h、48 h和72 h,采用MTT法、流式细胞术及半定量RT-PCR检测GS-Rg1对胃癌细胞的增殖抑制作用、细胞周期分布时相和p16~(INK4a)、p21~(WAF1)表达水平的影响,以探讨人参皂甙Rg1对人胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用及机制。结果表明,随着作用时间和浓度的增加,人参皂甙Rg1对胃癌细胞增殖抑制作用逐渐增强(P<0.05),G_0/G_1期细胞比例增加,G_2/S期细胞比例下降,p16~(INK4a)、p21~(WAF1)基因水平上调。上述结果提示人参皂甙Rg1能抑制体外培养的胃癌BGC-823细胞增殖,其机制可能与上调肿瘤细胞内细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p16~(INK4a)及p21~(WAF1)mRNA的表达有关。     

p16INK4a基因的功能及其调控

p16^INK4a蛋白能抑制CDK4和CDK6的活性,使pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态而能与转录因子E2Fs结合,从而抑制DNA 的合成,阻止细胞由G1期进入S期.p16^INK4a的表达受Ets1和Ets2的正调控,受Bmi-1的负调控.p16^INK4a基因缺失、突变、甲基化、RNA剪接加工错误可导致细胞周期失控和癌变.应用p16^INK4a对某些肿瘤进行基因治疗的研究正在进行中.     

细胞衰老的重要通路:p16INK4a/Rb和p19ARF/p53/p21Cip1信号途径

细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinase,CDK)抑制因子p16^INK4a,p21^Cipl等是细胞衰老的关键效应物。本文对涉及这些抑制物的两条衰老诱导途径作一综述,它们是p16^INK4a/Rb和p19^ARF/p53/p21^Cipl信号途径。其中,几个抑癌基因的产物R ,16^INFK4a,p53及p19^ARF处于两条途径的核心位置。     

可逆的组蛋白乙酰化调控p16的表达

p16^INK4a通过抑制CDK4/6的活性而在细胞周期进行中发挥重要的作用,研究发现,组蛋白乙酰转移酶p300能促进p16^INK4a启动子活性,而组蛋白去乙酰化酶HDAC3/4能够逆转由p300介导的p16^INK4a启动子活性的增加,HDAC3/4能够降低p16^INK4a mRNA和蛋白质的水平．染色质免疫沉淀(ChIP)实验结果表明转染p300表达质粒能够逆转由HDAC3/4介导的p16^INK4a启动子组蛋白的低乙酰化状态．此外,免疫荧光实验结果表明HDAC4的核质穿梭起着重要的作用．免疫印迹和染色质免疫沉淀实验证明HDAC的抑制剂丁酸钠盐(NaBu)能通过诱导组蛋白的高乙酰化而促进p16^INK4a的表达．基于这些实验结果,推测出可逆的组蛋白乙酰化参与p16^INK4a基因转录调控的模型．     

p16^INK4失活与肿瘤的发生

p16~(INK4)位于人类染色体9p2.1,其编码的蛋白为细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的抑制因子,直接调控细胞增殖周期。至今已在许多肿瘤发现有p16~(INK4)的缺失或失活,p16~(INK4)是一种多肿瘤抑制基因(Munltiple Tumor Sup-pressor Ⅰ,MTS_1),在不少肿瘤中其缺失或失活高达80％,是一种可以与p53基因相匹敌的肿瘤抑制基因。     

5-氮胞苷对转化后间充质干细胞增殖、衰老及p16~(INK4a)表达的影响

目的观察5-氮胞苷对体外自发转化的间充质干细胞增殖、衰老及p16INK4a基因表达的影响。方法采用细胞计数、SA-β-gal染色、Western Blot和重硫酸盐修饰后测序(BSP)检测体外自发转化的大鼠间充质干细胞在不同浓度5-氮胞苷处理后增殖、衰老、p16INK4a表达及p16INK4a基因启动子区CpG岛甲基化水平的变化。结果细胞计数显示5-氮胞苷可剂量依赖性地抑制转化后间充质干细胞的增殖,但增殖受抑的细胞SA-β-gal染色仍呈阴性。BSP及Western Blot分析显示:转化后间充质干细胞p16INK4a基因启动子区CpG岛呈现高水平甲基化(87.30±2.39%)。5-氮胞苷可在一定程度上降低该基因的甲基化,使p16INK4a表达得以部分恢复;但即使是高浓度高达100μmol/L,5-氮胞苷也只能使p16INK4a基因甲基化降低到46.20±1.65%。结论 5-氮胞苷可显著抑制转化后间充质干细胞的增殖,但并不能促使这些细胞重新恢复衰老状态;其原因是5-氮胞苷单独作用不足以完全解除p16INK4a基因启动子区DNA的高甲基化。     

p19~(ARF):INK4α编码的另一种细胞周期抑制蛋白

INK4α的重叠编码框架编码产生出两个不同的蛋白p16INK4α和p19ARF。p19ARF在最近的研究中表明有细胞周期阻滞作用,它发挥作用时依赖于P53。其机制是通过与MDMZ结合并加速其降解,减少了后者对p53的下调,从而引起p53的积聚。p19ARF－MDM2－p53通路的发现对INK4α基因座的功能是个很好的补充。同时也提示INK4α基因突变或缺失可能同时损害p16INK4α－CDK4N6－RB和p19ARF－MDM2－p53这两条通路。一些肿瘤细胞中也发现确实存在p19ARF基因的失活。     

p16INK4a基因的功能及其调控

p16INK4a蛋白能抑制CDK4和CDK6的活性,使pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态而能与转录因子E2Fs结合,从而抑制DNA 的合成,阻止细胞由G1期进入S期.p16INK4a的表达受Ets1和Ets2的正调控,受Bmi-1的负调控.p16INK4a基因缺失、突变、甲基化、RNA剪接加工错误可导致细胞周期失控和癌变.应用p16INK4a对某些肿瘤进行基因治疗的研究正在进行中.     

p14ARF对人黑色素瘤细胞增殖的影响及其作用机理的初探

ARF(alternative reading frame)作为INK4a/ARF的β转录产物,能够稳定p53, 诱导细胞周期阻断或凋亡.利用高表达p14^ARF的人黑色素瘤细胞模型,探讨了ARF抑制细胞增殖的分子作用机理.研究发现p14^ARF高表达能将细胞周期阻断在G1和G2期, p53, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显增强, 而p-ERK1/2,CyclinD1和CyclinE蛋白水平下降, 明显抑制细胞生长. 提示p14^ARF能通过ERK(extracellular signal-regulated kinase)信号通路相互协调作用抑制A375细胞增殖.     

高危型人乳头瘤病毒感染后TopoⅡα和p16INK4A蛋白的表达及诊断价值

目的 探讨高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染后TopoⅡα和p16INK4A在宫颈组织中的表达及其对癌前病变的诊断价值.方法 选取在温州医学院附属二院行宫颈病变诊治的患者135例,包括各级宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈鳞癌(SCC)的患者.随机选取同期就诊的慢性宫颈炎患者30例作为对照.运用第二代杂交捕获法(HC2)检测高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的表达.活体提取组织,运用免疫组织化学法(SP法)检测宫颈组织中Topo Ⅱα和p16INK4A蛋白表达.结果 在HR-HPV阳性患者的宫颈组织中Topo Ⅱα和p16INK4A表达率高于HR-HPV阴性患者,差异有统计学意义.Topo Ⅱα和p16INK4A在正常宫颈上皮组织、各级CIN和SCC中的表达率逐渐增加,差异有统计学意义.p16INK4A用于筛查宫颈癌前病变(包括SCC)时阳性预测值99.3％.Topo Ⅱα用于筛查宫颈严重病变(CINⅢ和SCC)时阳性预测值67.9％.结论 HR-HPV感染后Topo Ⅱα和p16INK4A蛋白表达明显增高,并且Topo Ⅱα和p16INK4A蛋白表达率随着宫颈癌前病变的严重程度而上调,参与宫颈上皮的异常增殖和恶性转变.p16INK4A免疫组化检测提高了宫颈癌前病变筛查的特异性,Topo Ⅱα免疫组化检测提高了宫颈严重病变筛查的特异性,当Topo Ⅱα蛋白表达阳性,宫颈组织可能已发生不可逆性病变.     

人成纤维细胞转录因子Sp1Sp3对p16~(INK4a)基因的调控

p16 INK4a是一种细胞周期蛋白依赖激酶 (cdk)的抑制因子 ,它通过抑制cdk4与cdk6的活性 ,使视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb处于低磷酸化状态 ,从而使细胞阻滞于G1期 .对p16 INK4aATG上游 6 2 2bp片段进行序列分析发现 ,该区域富含GC ,其中有 5个GC盒 (分别命名为GC Ⅰ～GC Ⅴ ) .将上述片段插入到荧光素酶报告载体pGL3 Basic ,分别对 5个GC盒进行点突变后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)发现 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的突变体显著下调p16 INK4a启动子的活性 ,而Ⅲ、Ⅴ位点突变体无明显作用 .电泳迁移率变动分析 (EMSA)证实 ,GC Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅳ能与转录因子Sp1和Sp3结合 ,而且结合条带可被转录因子Sp1和Sp3的抗体所拮抗 .共转染Sp1有助于增加启动子的活性 ,而共转染Sp3则有较弱的抑制作用 ,证明p16 INK4a的转录受到Sp1与Sp3的调控 .     

氧化应激与2型糖尿病的研究进展

氧化应激与2型糖尿病(T2DM)的发生、发展密切相关.胰岛素抵搞(Insulin Resistance,IR)、胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病的主要病因.而氧化应激可以直接及间接激活细胞内的一系列应激信号通路,如核因子κ-B(Nuclear factor-KappaB,NF-κB)、c-Jun氨基端激酶(NH-terminal Jun kinase,JNK)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)等.这些应激通路的激活可以产生以下结果:(1)阻断胰岛素作用通路,导致胰岛素抵抗;(2)降低胰岛素基因表达水平,致胰岛素合成和分泌减少;(3)促进胰岛β细胞凋亡等.本文针对氧化应激诱导胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损等机制加以综述,以便进一步阐明2型糖尿病的发病机制.     

p18~(INK4C)调控小鼠T细胞的发育及功能

p18INK4C属于细胞周期蛋白激酶抑制剂,其突变或缺失与某些肿瘤的发生密切相关,如T细胞白血病,但目前关于p18调控T细胞发育及功能的研究还鲜有报道,其调控机制仍不明确.本研究利用p18基因敲除(p18KO)小鼠,系统地研究了胸腺中T细胞的早期发育及成熟T细胞的增殖和活化功能,并利用逆转录病毒的方法在Lin?造血干祖细胞上过表达p18,移植4个月后检测其对T细胞的影响.结果表明,p18的缺失对胸腺T细胞的早期发育影响不明显,但随着p18KO小鼠周龄的增加会促进CD4+CD8+双阳性T细胞的数量,此外,p18还通过影响CD3+成熟T细胞的细胞周期进程及IFN-?,GATA3,Tbx21和Foxp3等的表达增强脾脏T细胞的增殖和活化;进一步在造血干祖细胞上过表达p18后会影响T细胞的发育和成熟,进而纠正T细胞在数量上的异常.本研究阐释了p18在T细胞早期发育及后期活化中的调控机制,并证实可通过在干祖细胞水平改变p18的表达进而影响T细胞的分化,这对p18调控T细胞功能异常及参与T细胞白血病的发生提供了新的理论依据和重要的研究价值.