噬菌体裂解细菌过程中冷光实时监测活菌方法的建立

产毒素的霍乱弧菌Vibrio cholerae可导致严重腹泻,已引起7次全球大流行。对于烈性噬菌体清除霍乱弧菌的效果评价上,一般使用传统的活细胞培养计数及噬菌斑进行观察分析,但操作费时耗力,尤其不能实时获得菌株被裂解及残存细胞的数量变化。进一步探索简便、能够实时监测噬菌体裂解霍乱弧菌的方法是非常必要的。利用荧光报告质粒的策略、将可在霍乱弧菌中高表达生物冷光的质粒转化至O1血清群霍乱弧菌耐药菌株中,通过测定比较生物冷光以及活菌计数,实时分析了噬菌体对液体培养状态下霍乱弧菌的裂解效果,结果显示：冷光值作为监测指标与传统的活细胞计数方法有很高的相关性,通过测定霍乱弧菌耐药株的冷光值监测霍乱弧菌活细胞的数量,可实时分析噬菌体裂解霍乱弧菌过程中细菌残存数量。这种分析方法与菌落计数和噬斑形成观察相比,能够重复对同一样本进行无干扰的连续多时间点检测,没有经过再培养或噬斑形成的时间迟滞,有利于进行噬菌体与宿主菌相互作用的实时监测分析。     

4株霍乱弧菌非产毒株溶源性噬菌体pre-CTXΦ 的基因组结构分析

霍乱弧菌溶源性噬菌体CTXΦ携带霍乱毒素基因ctxAB,通过其结构基因gⅢ编码产生的PⅢ蛋白识别霍乱弧菌毒素共调菌毛(toxin co-regulated pilus, TCP)的主要结构亚单位TcpA,从而感染具有TCP的霍乱弧菌,使之成为产毒菌株。CTXΦ还有不携带ctxAB的前体pre-CTXΦ,根据CTXΦ基因组中调控基因rstR序列型不同,可分成不同的型别。在不同霍乱弧菌菌株的基因组中,已发现CTXΦ/pre-CTXΦ基因组及其亚型的多种组合排列方式。研究该噬菌体家族的基因组多样性,能够分析其进化及在霍乱弧菌产毒株形成中的作用。本研究发现了4株O1和O139群霍乱弧菌非产毒株具有pre-CTXΦ基因组及多样的rstR序列型,进一步对pre-CTXΦ在4株菌株中的基因组特征进行了分析。利用第3代基因测序法(短读长测序技术和单分子长读长测序技术),获得了4株菌株的基因组序列。利用长读长测序和拼接分析,精确地获得了具有长片段重复序列结构的pre-CTXΦ基因组排列,明确了4株测序菌株中多样的pre-CTXΦ基因组排列。在非产毒株基因组菌株VC3193中发现了携带古典型pre-CTXΦ;还在菌株VC702的pre-CTXΦ基因组中首次发现了肺炎克雷白菌的转座子结构(Gen Bank序列号：SRIL00000000)。在这4株测序菌株中,受体TcpA以及pre-CTXΦ的PⅢ蛋白也具有明显差异的序列,有 TcpA和PⅢ新序列型,这提示了CTXΦ家族感染宿主菌的受体-配体相互识别的复杂对应关系。本研究丰富了对CTXΦ/pre-CTXΦ家族基因组及其整合排列的多样化认识,也为分析该溶源性噬菌体在不同遗传特征霍乱弧菌菌株间的水平转移和促使新产毒克隆形成方面提供了更多的证据。     

三氟拉嗪通过诱导p16INK4a抑制BGC-823细胞增殖

为探索三氟拉嗪（trifluoperazine, TFP）抗肿瘤作用机制,对胃癌BGC-823细胞进 行TFP（5、10 μmol/L）处理后,利用计数法、BrdU脉冲标记法、Western印迹等方法从细胞形态、细胞增殖、S期细胞百分比以及相关因子表达水平等方面进行分析. 结果显示,TFP处理后,细胞形态发生明显改变,细胞增殖受到明显抑制且呈时间计量 效应关系;S期细胞比例下降;p16INK4a表达水平升高.为进一步研究TFP诱导 p16INK4a表达的分子机制,本实验采用插入p16INK4a启动子片段及荧光素酶报告系统 的载体pGL3-Basic-p16INK4a（-967~-165 bp）,研究了TFP在转录水平对p16INK4a启 动子活性的影响.结果表明, TFP能够提高p16INK4a的启动子活性.上述结果提示,TFP 通过诱导p16INK4a表达抑制BGC-823细胞增殖.     

细菌双杂交系统的优化及其应用

细菌双杂交系统是一种用于检测体内蛋白质互作的方法，该方法互补腺苷酸环化酶功能，通过检测细胞表达的β-半乳糖苷酶LacZ的活性，分析蛋白质互作能力。但在应用过程中，发现存在操作繁琐、灵敏度低、难实现高通量操作等缺陷。本研究目的是对原有细菌双杂交进行优化，建立一种操作方便、可批量操作、具有较高灵敏度和能够实现实时监测的细菌双杂交系统，本研究成功构建由lacZ启动子控制的luxCDABE的报告质粒pBBR-lacZ-luxCDABE，引入原有的检测系统，新的判读标准并不影响原有的判读标准，本文通过快速灵敏地冷光观察菌落或测定菌液冷光值即可判读结果，优化后的双杂交系统，阳性对照组冷光值为阴性对照组的几十（霍乱弧菌为宿主）至几百倍（大肠杆菌为宿主），阴阳性结果判读差异明显，不仅节约实验成本，提高工作效率，又实现了连续监测。该系统不仅以大肠杆菌为宿主获得成功应用，宿主范围也扩展到霍乱弧菌。该系统通过质粒将lacZ启动子的拷贝数提高，减弱了非腺苷三磷酸（cAMP）因素引起的lacZ启动子活性的干扰，无需繁琐耗时的实验操作，为大批量的蛋白质互作分析及互作蛋白质的筛选提供了有利工具。