小鼠胚胎干细胞p16^INK4a基因外显子1a打靶研究

在活体水平上,小鼠p16^INK4a基因是否具有抑制肿瘤发生和发展的功能是一个悬而未决的问题。利用筛选基因组文库得到的小鼠p16^INK4a基因组DNA片段,构建了针对小鼠p16^INK4a基因外显子1a的基因打靶载体,其短臂为1.5kbEco81 I/AccⅡ片段,长壁为5.9kb Xba I/Xho I片段。打靶载体经线性化和纯化后通过电穿孔转导小鼠R1 ES细胞,获得37个G418和Gancyclovir双药抗性克隆。用Southern杂交法对双药抗性克隆进行鉴定,获得一个敲除了p16^INK4a基因外显子1a的阳性ES细胞克隆。     

人t-PA突变体cDNA打靶敲入小鼠ES细胞β-酪蛋白位点的研究

应用克隆的基因组序列作为同源臂 ,构建了小鼠 β 酪蛋白基因定位敲入打靶载体。短臂长 2 7kb ,包括小鼠 β 酪蛋白基因 5′端侧翼区、第 1外显子、第 1内含子、部分第 2外显子。长臂包括小鼠 β 酪蛋白基因部分第 2内含子、第 3～ 7外显子、第 3～ 6内含子、部分第 7内含子 ,长 3 4kb。人t PA突变体cDNA在第 2外显子中与小鼠 β 酪蛋白信号肽序列融合。正筛选标记neo放置在 β 酪蛋白基因第 2内含子中部 ,负筛选标记tk位于短臂外侧。ES细胞株TC 1在滋养层上培养扩增。处理ES细胞使其密度达到 2× 10 7个 /mL后 ,将 4 5 μg线性化的打靶载体DNA与 1mL细胞混匀后电击。转染的细胞在含G4 18和Gancyclovir的选择培养基中培养 ,7d后挑取 192个抗性克隆 ,扩增、提取基因组DNA ,EcoRⅠ酶切后 ,用打靶载体 5′端内侧探针进行Southern杂交 ,野生型出现 9 8kb ,而中靶的 β 酪蛋白基因由于敲入的人t PA突变体携带一个EcoRⅠ位点 ,中靶等位基因出现 6 6kb。从 78株ES细胞株中获得 1株发生正确同源重组的中靶ES细胞。     

小鼠p16~(INK4a)基因位点的结构和功能研究

p1 6INK4a基因的失活与多种肿瘤的发生和发展有联系。通过筛选小鼠基因组文库 ,获得长度为 1 4.5kb的p1 6INK4a基因组DNA片段。对上述 1 4.5kbDNA测序后进行生物信息学分析表明 :该片段包含 3个外显子 ,编码 1个由 1 68个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量的理论计算值为 1 7941 ,有 7个可能的磷酸化位点 ,说明p1 6INK4a蛋白的功能可能受到磷酸化的调控。该DNA片段的非编码区分布着大量短散布元件、长散布元件和简单重复序列 ,这样的结构为转座和同源重组提供了结构基础 ,提示了部分肿瘤细胞中p1 6INK4a基因缺失的可能原因。对第一外显子序列与已发表的相应序列比较发现其DNA序列和所编码的多肽存在多态性     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

小鼠p16^INK4a基因位点的结构和功能研究

p16^INK4a基因的失活与多种肿瘤的发生和发展有联系。通过筛选小鼠基因组文库,获得长度为14.5kb的p16^INK4a基因组DNA片段。对上述14.5kbDNA 测序后进行生物信号学分析表明：该片段包含3个外显子,编码1个由168个氨基酸残基组成的多肽,其相对分子质量的理论计算值为17941,有7个可能的磷酸化位点,说明p16^INK4a蛋白的功能可能受到磷酸化的调控。该DNA片段的非编码区分布着大量短散布元件、长散布元件和简单重复序列,这样的结构为转座和同源重组提供了结构基因,提示了部分肿瘤细胞中p16^INK4a基因缺失的可能原因。对第一外显子离列与巳发表的相应序列比较发现其DNA序列和所编码的多肽存在多态性。     

青鳉p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long PCR”技术 ,用 6对 p5 3引物从青胚胎干细胞基因组DNA中扩增出 6个相互重叠的片段 ,其中最大的片段长达 4 5kb ,这 6个PCR片段覆盖了整个 p5 3基因。序列分析表明青p5 3基因长约 8 7kb ,由 11个外显子和 10个内含子组成。结构比较表明 ,青 p5 3基因在大小上与人和小鼠 p5 3基因存在较大差异。青p5 3基因的内含子 1仅为 0 85kb ,而人和小鼠p5 3基因的内含子 1则分别长达 10kb和 6kb ;青 p5 3基因的外显子 3(86bp)明显大于人和小鼠 p5 3基因的外显子 3(2 2bp) ;外显子 4 (170bp)比人 (2 80bp)和小鼠 (2 6 0bp)的外显子 4小 ;内含子 10 (3 5kb)则比人和小鼠内含子 10 (0 7kb和 0 9kb)大得多。用SVTK neo基因作正选择标记基因 ,用SVTK tk基因作负选择标记基因 ,用青 p5 3基因组片段作同源序列 ,构建了鱼类 p5 3基因同源重组载体。将此载体转染青胚胎干细胞 ,并经G4 18和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 ,并提供对G4 18的抗性和对Ganc的敏感性。     

p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立

目的　构建pCR○R3 1 p16真核表达质粒 ,并建立其稳定表达的NIH3T3细胞株。方法　将人的p16cDNA亚克隆至pCR○R3 1,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌 ,筛选阳性克隆 ,进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定及DNA测序 ,将已鉴定的pCR○R3 1 p16经脂质体介导转染至NIH3T3细胞中。结果　重组质粒双酶切后 ,出现约 80 0bp片段 ,提示p16cDNA片断已插入pCR○R3 1多克隆位点内 ,DNA测序显示p16cDNA按照正确方向和阅读框插入表达载体pCR○R3 1。通过pCR○R3 1 p16转染NIH3T3细胞 ,获得 10个G4 18抗性克隆 ,其中 2个为RT PCR阳性。结论　成功构建pCR○R3 1 p16真核表达载体并建立了其稳定表达的NIH3T3细胞株。为建立p16转基因鼠奠定基础。     

青Jiang p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long-PCR”技术,用6对p53引物从青Jiang胚胎干细胞基因组DNA中扩增出6个相互重叠的片段,其中最大的片段长达4.5kb,这6个PCR片段覆盖了整个p53基因。序列分析表明青Jiang p53基因长约8.7kb,由11个外显子和10个内含子组成。结构比较表明,青Jiang p53基因在大小上与人和小鼠p53基因存在较大差异。青Jiang p53基因的内含子1仅为0.85kb,而人和小鼠p53基因的内含子1则分别长达10kb和6kb;青Jiang p53基因的外显子3（86bp)明显大于人和小鼠p53基因的外显子3（22bp);外显子4（170bp)比人（280bp)和小鼠（260bp)的外显子4小;内含子10（3.5kb)则比人和小鼠内含子10（0.7kb和0.9kb)大得多。用SVTK－neo基因作正选择标记基因,用SVTK－tk基因作负选择标记基因,用青Jiang p53基因组片段作同源序列,构建了鱼类p53基因同源重组载体。将此载体转染青Jiang胚胎干细胞,并经G418和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达,并提供对G418的抗性和对Ganc的敏感性。     

黏蛋白1基因敲除小鼠模型的构建

黏蛋白1(MUC1)属黏蛋白家族成员,分布于上皮细胞膜表面,由于在免疫炎症反应以及肿瘤发生中的重要作用而日益受到重视.为了进一步深入研究MUC1的生物学功能,构建了Muc1基因敲除小鼠模型.首先,根据小鼠Muc1基因组序列设计基因剔除策略,将2个loxP位点分别插在外显子2和3两侧,构建基因剔除载体Muc1-ABRLFn-pBR322.以电穿孔方法将载体导入胚胎干细胞(ES细胞),用G418和更昔洛韦进行正负筛选获得4个同源重组的ES细胞克隆.挑选其中一个阳性ES克隆行囊胚显微注射,获得16只嵌合率大于50%的雄鼠;其次,利用嵌合雄鼠与C57BL/6J野生型雌鼠交配后获得11只floxP杂合子小鼠(10雄1雌),通过杂合子小鼠回交,并进一步与EⅡa-Cre小鼠交配,最终成功得到Muc1全身敲除小鼠,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.初步表型观察未发现Muc1基因敲除相关器官组织结构的异常改变.本研究为MUC1的生物学功能的挖掘,尤其是MUC1在肿瘤发生转移中的作用机制的揭示提供了实验平台.     

小鼠KGF基因毛囊特异性表达载体的构建及mESC脂质体悬浮转染条件的优化

旨在构建小鼠角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体pCDsR-UKA,通过脂质体转染法转染小鼠胚胎干细胞( mESC),并进一步优化其转染条件,最终获得可以正常生长并稳定表达红色荧光蛋白的转KGF基因的ES细胞.利用RTPCR技术扩增小鼠KGF基因cDNA并构建表达载体pCDsR-UKA (6.6 kb),经鉴定正确的重组质粒DNA用脂质体包裹后转染mESC.从小鼠成纤维细胞cDNA扩增出891 bp的KGF基因片段与UHS启动子和BGH polyA序列成功重组到pCDsRed2载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为KGF基因且方向正确.采用脂质体法优化转染条件,mESC最高转染效率达到(34.4±4.1)％.经G418筛选的转基因ES细胞通过PCR鉴定证实外源基因已整合在ES细胞基因组中.成功获得了小鼠KGF基因片段,以及真核表达载体pCDsR-UKA,经优化的脂质体悬浮法转染条件,在六孔板中当DNA与脂质体比例为3:10时,可获得最佳转染效率且不改变ES细胞的生长状态,经筛选获得了转基因ES细胞克隆.为下一步通过四倍体补偿技术获得ES小鼠提供了转基因ES细胞.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5a多克隆抗血清的制备

构建XX2012株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5a蛋白基因的真核表达载体,并制备出GP5a蛋白的多克隆抗血清。以XX2012株PRRSV GP5a蛋白的基因序列为扩增模板,设计并合成一对特异性扩增引物,通过RTPCR扩增得到该病毒株的GP5a蛋白全长基因片段,将其定向克隆到真核表达载体p CAGG中,构建含有GP5a蛋白基因的重组表达载体p CAGGS-GP5a,并将获得的p CAGGS-GP5a载体采用基因免疫的方式免疫BALB/c小鼠制备GP5a蛋白的多克隆抗体。结果显示,成功克隆出了XX2012株PRRSV GP5a蛋白全长基因,片段大小为156 bp;构建的p CAGGS-GP5a载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;通过三次基因免疫小鼠成功制备出了GP5a蛋白的多克隆抗体,间接免疫荧光试验证实制备出的多克隆抗体能特异性识别病毒感染后的细胞。由此获得了PRRSV GP5a蛋白基因的真核表达载体,制备出了GP5a蛋白的特异性多克隆抗血清,为今后开展GP5a蛋白的亚细胞定位及相关功能的研究奠定了基础。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的：构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将 Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因 R528H 突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

巢式PCR克隆猪T细胞表面抑制性受体PD-1全长基因

为了获得猪T细胞表面抑制性受体PD-1的全长基因,本研究根据猪T细胞表面抑制性受体PD-1的c DNA序列,设计合成2对引物P1/P2、P3/P4,并在P1和P2的5'端分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点。应用巢式PCR技术从感染猪瘟病毒(CSFV)石门株的猪外周血单个核细胞中,扩增获得了大小为866 bp的基因片段。将扩增的目的基因回收、纯化,克隆至p MD-18 T克隆载体,转化宿主菌DH5α。菌液PCR和质粒PCR选择可疑阳性重克隆质粒,抽提质粒,然后用Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,最后进行基因序列测定。结果表明,成功构建猪PD-1全长基因的重组质粒(p MD-PD1)。     

三氟拉嗪通过诱导p16INK4a抑制BGC-823细胞增殖

为探索三氟拉嗪（trifluoperazine, TFP）抗肿瘤作用机制,对胃癌BGC-823细胞进 行TFP（5、10 μmol/L）处理后,利用计数法、BrdU脉冲标记法、Western印迹等方法从细胞形态、细胞增殖、S期细胞百分比以及相关因子表达水平等方面进行分析. 结果显示,TFP处理后,细胞形态发生明显改变,细胞增殖受到明显抑制且呈时间计量 效应关系;S期细胞比例下降;p16INK4a表达水平升高.为进一步研究TFP诱导 p16INK4a表达的分子机制,本实验采用插入p16INK4a启动子片段及荧光素酶报告系统 的载体pGL3-Basic-p16INK4a（-967~-165 bp）,研究了TFP在转录水平对p16INK4a启 动子活性的影响.结果表明, TFP能够提高p16INK4a的启动子活性.上述结果提示,TFP 通过诱导p16INK4a表达抑制BGC-823细胞增殖.     

ht-Pam基因在山羊β-酪蛋白基因座定位整合的研究

利用体细胞基因打靶与核移植技术制备动物乳腺生物反应器是当今转基因定位整合表达的一种新技术。分别克隆山羊的β-酪蛋白基因5′调控区的6.3kb片段,外显子7、外显子8和9三个基因片段,并与克隆的人tPA突变体cDNA一起构建了含有neo和tk正负筛选标记基因的β-酪蛋白基因打靶载体P^GBC4tPA,并验证了neo基因、tk基因以及Cre-LoxP系统的有效性。将线性化的P^GBC4tPA通过电转染整合到山羊胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,初步获得抗性细胞克隆244个,PCR检测后获得阳性细胞克隆31个,其中初步验证2个细胞克隆转植基因整合位点重组后的基因序列正确,并且该细胞克隆能够有效扩增。这为下一步基因打靶体细胞核移植制备山羊乳腺生物反应器奠定了基础。     

四价抗马铃薯病毒植物表达载体构建及其对烟草的转化

该研究为了培育兼抗4种病毒的马铃薯品种,采用RT-PCR技术对PVX、PVS、PVY和PLRV的外壳蛋白(CP)基因进行克隆与分析,获得了大小分别为670、800、700、600 bp的CP基因序列,将获得的CP基因序列与NCBI中已报道的序列进行比对分析,其同源性都在96%以上。根据所克隆的CP基因对靶标片段进行筛选,获得了大小约300 bp的靶标片段PVX-rh、PVS-rh、PVY-rh和PLRV-rh,同时利用Overlap-PCR技术将4种病毒的靶标片段进行拼接,得到了长度约为1 200 bp的融合片段XSYV-rh,与预期目标片段XSYV-yxz的相似性达100%。利用DNA重组技术将融合片段XSYV-rh克隆到p GM-T载体上构建成克隆载体p GM-T-XSYVrh,用SpeⅠ和SacⅠ对克隆载体p GM-T-XSYV-rh和植物表达载体p ART27进行同步双酶切,用T4 DNA连接酶将XSYV-rh片段连接到载体p ART27上,成功构建了同时含4种病毒CP基因片段的植物表达载体p ART27-XSYV-rh。采用直接转化法将植物表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,并利用农杆菌介导法对烟草品种T12试管苗进行遗传转化,转化后的烟草植株经PCR检测,有40株转化植株可扩增出目的条带,表明XSYVrh融合基因已成功转入烟草基因组中。     

p16INK4a在早孕小鼠子宫内膜的表达及其对胚泡着床的影响

本研究旨在检测肿瘤抑制基因p16INK4a(inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a)在早孕小鼠子宫内膜中的表达规律,探讨p16INK4a在小鼠胚胎着床过程中的作用.采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和免疫组织化学方法分别检测未孕小鼠及孕小鼠第2、3、4、5、7天子宫内膜p16INK4a mRNA和蛋白的表达;子宫角注射p16INK4a抗体观察胚泡着床数.FQ-PCR结果显示孕小鼠子宫内膜组织p16INK4amRNA的表达高于未孕小鼠,且随着妊娠天数的增加呈现表达逐渐增强的趋势,到妊娠第5天达到最高,后渐降.免疫组织化学分析显示p16INK4a蛋白在子宫内膜的表达规律与mRNA结果一致.子宫角注射p16INK4a抗体后胚泡着床数明显减少.以上结果提示,P161INK4a在妊娠早期子宫内膜持续表达,可能参与胚泡着床.     

小鼠胚胎干细胞中MT—Ⅱ基因的定位改变

构建了小鼠MT－Ⅱ基因的定位整合载体pMT－Ⅱ6.7,这是一个置换型载体,它包含了6．7kb的与MT－Ⅱ基因及其旁侧序列同源的序列。用电穿孔方法将这一载体转化入小鼠ES细胞Mespu22中,在G418R、GancR的双抗性克隆中,用PCR方法进行筛选,从104个克隆中获得26个阳性克隆;对这26个克隆进行核型分析表明,其中有2个克隆,即克隆5－2和8-4的核型（2n=40,XY）正常率很高,达到84％和88％;进一步用Southern杂交分析,结果证明,在MT－Ⅱ基因位点确实发生了定位整合事件。利用这两个克隆的细胞进行体内、体外分化实验表明,它们具有体内、体外分化能力,进一步进行了嵌合体的制作,现已获得用克隆8-4细胞制作的嵌合体小鼠。     

慢病毒介导Nanog基因在小鼠ES细胞的表达

试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。根据小鼠Nanog基因m RNA序列设计Nanog基因引物,引物两端带有Nhe I和Xho I酶切位点。Trizol试剂处理小鼠ES细胞,通过RT-PCR扩增出小鼠Nanog基因,小鼠Nanog基因用Nhe I和Xho I酶切后连入pcDNA3.1载体中,PCR检测阳性的细菌克隆进行测序,测序正确的Nanog基因片段连接入PLL-IRES-Neo慢病毒表达载体中,包装含有Nanog基因的慢病毒感染小鼠ES细胞,在SNL细胞饲养层上G418筛选2周后,添加普通ES细胞培养液在普通小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养。结果显示通过RT-PCR扩增出918 bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。