丁氏双鳍电鳐(Narcine timlei)电器官烟碱型乙酰胆碱受体(AChR)某些生化性质的研究

本文报道了丁氏双鳍电鳐（Narcine timlei）电器官烟碱型乙酰胆碱受体蛋白（AChR）的某些生化性质。纯化的AChR经聚丙烯酰胺梯度（4％—30％）凝胶电泳,呈现一个主要蛋白带,经测定,表观分子量为440,000,与~（125）I-α-Bgt-AChR复合物的分子量相一致。等电聚焦电泳测得纯化AChR和~（125）I-α-BgtAChR的等电点（pI）分别为4.9和5.2;经SDS—聚丙烯酰胺梯度（4％—30％）凝胶电泳,纯化的AChR解离成三个主要亚基蛋白带,它们的表观分子量分别为38,000,42,000和66,000,其中前两个亚基的含量很高,约占总数75％。氨基酸组成分析表明,丁氏双鳍电鳐电器官AChR由18种氨基酸组成,（色氨酸未测定）,其中酸性氨基酸含量很高,占总数的20％以上,说明纯化的AChR是一个复杂结构的酸性蛋白大分子。     

丁氏双鳍电鳐电器官烟碱样胆碱能受体的分离提纯

本文用湖南眼镜蛇神经毒素为配基偶联的AH-Sepharose 4B毒素型亲和凝胶从国产丁氏双鳍电鳐电器官中提纯了烟碱样胆碱能受体(N-ChR)。提纯123倍,产率5.4%,比结合力5.411nmole毒素结合部位/mg受体蛋白,每毫升湿胶可制备受体蛋白0.037毫克。AH-Sepharose 4B的亲和分离效能与CN-Sepharose 4B无明显差别。用AH-Sepharose 4B毒素型亲和凝胶提纯的N-ChR经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白区带。SDS凝胶电泳主要显示四个亚基,分子量分别为4.1、4.7、5.6及6.7万道尔顿。丁氏双鳍电鳐电器官N-ChR与其他种属电鱼电器官N-ChR的亚基近似。     

金环蛇神经毒素与乙酰胆碱受体结合的特点

进一步纯化了前一工作中从广西省产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒分离的突触后毒素Ⅰ和Ⅱ。以超饱和剂量的毒素Ⅰ或Ⅱ先与从电鳐(Narcine maculata)电器官得到的乙酰胆碱受体(AChR)保温10min 或 lh,再加入~(125)Ⅰ-标记α-银环蛇毒素或~(125)Ⅰ-标记眼镜蛇毒素,继续保温10min 或 lh,由测定与 AChR 结合的放射性强度得知,如以未经毒素Ⅰ或Ⅱ预饱和的放射性强度为100%,则经与其一预饱和者的约为30%,即毒素Ⅰ或Ⅱ只竞争地阻遏了α-银环蛇毒素或眼镜蛇毒素与 AChR 结合能力的2/3左右。文中讨论了存在两种类型 AChR 的可能性。     

丁氏双鳍电鳐电器官乙酰胆碱受体膜微囊的分离

本文报告了从丁氏双鳍电鳐电器官中分离纯化膜结合烟碱样乙酰胆碱受体的简便方法。比活性达1750nmolα-毒素结合点/克蛋白质,无乙酰胆碱酯酶活性,可避免它的干扰。电镜检查发现受体的膜结合物成微囊状,直径约0.1—0.3μα-毒素结合试验及聚丙烯酰胺凝胺电泳结果证明具有烟碱样胆碱能受体性质,适于受体功能和性质的研究。     

电鳐电器官的蝮蛇突触前神经毒素结合蛋白的一些结合性质

电鳐（Ｔｏｒｐｅｄｏｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）的电器官是一种富含突触的组织．将这种电器官的粗制膜悬液与同位素１２５Ｉ标记的β－蝮蛇神经毒素进行结合实验,结果表明这种电器官中存在相对含量较高的毒素结合位点,Ｂｍａｘ为１１５０ｆｍｏｌ／ｍｇ,ＫＤ为２．８×１０－８ｍｏｌ／Ｌ．响尾蛇神经毒素和β－银环蛇神经毒素对其结合作用的抑制实验显示,前者与β－蝮蛇神经毒素有共同的结合位点,后者的作用位点则不同．提示β－蝮蛇神经毒素结合位点可能涉及一种新的参与突触前递质释放机制的功能蛋白     

眼镜蛇属神经毒素研究概况

正世界范围内眼镜蛇属约28种[1]。我国有舟山眼镜蛇(naja atra)和孟加拉眼镜蛇(naja kaouthia)两种,前者过去又称为中华眼镜蛇[2]。眼镜蛇是腺管牙类毒蛇,其毒腺分泌的毒液是以神经毒为主的混合毒,即神经毒和血循毒。眼镜蛇毒神经毒素(cobra neurotoxin,CNT)是其毒液中毒性最大的成分,它能使动物产生呼吸抑制和骨骼肌麻痹,甚至死亡[3]。随着分子生物学和蛋白质组学的发展,眼镜蛇毒神经毒素的一些组分已得到分离、纯化、测定,并广泛应用于科研和临床。本文就眼镜蛇毒组分中神经毒素的研究与应用进     

利用黑斑双鳍电鳐构建实验性自身免疫性重症肌无力小鼠模型

目的建立符合国际化的临床前实验标准的实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)动物模型。方法参照文献报道的方法并改进后,从电鳐电器官提取乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR)蛋白纯品,并采用SDS凝胶电泳蛋白定性鉴定及BCA法蛋白定量;用纯化的蛋白主动免疫C57BL/6小鼠,共免疫3次(分别于第1天、第30天、第60天),进行EAMG小鼠临床评分、体重、血清AchR抗体含量、新斯的明试验、肌电图等综合评价。结果 EAMG模型组与佐剂组比较,自第三周开始发病,平均临床评分显著上升(P<0.01);发病小鼠体重显著减轻(P<0.01);新斯的明试验阳性;血清AchR抗体含量明显增加(P<0.01);肌电图重复电刺激实验阳性。结论从黑斑双鳍电鳐的电器官提取、纯化AchR蛋白成功诱导C57BL/6 EAMG小鼠模型,为进一步研究重症肌无力创造了良好条件。     

中国眼镜蛇血清白蛋白的部分氨基酸序列

中国眼镜蛇血清白蛋白是一种酸性蛋白,等电点4.1±0.1,分子量70500。它能和同源的蛇神经毒素和心脏毒素结合。生理条件下,白蛋白和~(125)I-神经毒素分子结合比为1:8±1。白蛋白的存在可使小鼠对蛇毒的耐受性成倍提高,并显著抑制心脏毒素的溶血作用。对白蛋白氨基酸序列的研究有助于白蛋白-毒素作用机理的研究,并揭示眼镜蛇的自我解毒功能。     

rhM-CSFsR在大肠杆菌中的表达及其配基结合活性分析

从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增出巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR)胞外具有结合活性区域的cDNA,经平端连接将其克隆到原核表达载体pET-28a的His-Tag下游,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,重组的人可溶型M-CSFR(rhM-CSFsR)在宿主菌中获得高效表达,表达量约占菌体总蛋白的38%.重组蛋白经Ni2+组氨酸结合树脂螯合层析柱纯化,获得了纯化的rhM-CSFsR,经SDS-PAGE显示为单一区带,其表观分子量为34kD.用酶联免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)证明rhM-CSFsR有明显的M-CSF专一结合活性,Kd值为7.8nmol/L,只有一个M-CSF结合位点.本实验结果显示原核表达的rhM-CSFsR具有明显的配基结合活性,提示M-CSFR的糖基化程度对于其配基结合活性不是必不可少的,为深入进行rhM-CSFsR的生物学功能及其临床意义的研究打下了良好的基础     

眼镜蛇毒中降压因子的提取及其降血压作用的研究

目的：从广西眼镜蛇蛇毒中分离纯化血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACEI),命名为降压因子（Hypotensive Factor,HF）,并测定其生物活性。方法：采用Sephacryl S-100凝胶过滤,CM Sepharose F.F.离子交换层析分离纯化HF,高效液相鉴定纯度,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子量,紫外分光光度法测定HF对血管紧张素转换酶（ACE）的抑制活性。用离体兔子十二指肠平滑肌测定HF增强缓激肽(Bradykinin,BK)的效应。结果：纯化的广西眼镜蛇蛇毒HF经SDS-PAGE检测显示单一条带,测得其相对分子量约为8.2kD,由十二种氨基酸组成,蛋白回收率为5.70%。HF对ACE有明显的抑制作用,其抑制作用与剂量呈正相关。IC50为1.02?g/ml。HF能增强BK对离体兔子十二指肠平滑肌的收缩效应。结论：本方法成功地从广西眼镜蛇蛇毒中纯化出降血压成分。该成分与血管紧张素转换酶抑制剂作用相似,对血管紧张素转换酶有明显的抑制作用。     

眼镜蛇神经毒的免疫化学研究（摘要）

台湾产的眼镜蛇(Naja naja)的蛇毒经分离所得结晶体,属强碱性的突触后神经毒素,分子量为7000,是双硫键结合的多肽物,(如图1)     

蝮蛇突触前神经毒素的纯化及其生化性质的进一步研究

本文在前文的基础上,改进了蝮蛇神经毒素的分离方法,纯化了蝮蛇毒中的两个神经毒素之一,突触前神经毒素Agkistrodotoxin(简写为ATX),并对其生化特性进行了分析。应用DEAE-纤维素柱层析、CM-葡聚糖凝胶柱层析和聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳等方法分离纯化,得到一个均一的神经毒素蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶在pH碱性和pH酸性电泳鉴定,都呈现一条区带。氨基酸定量分析结果表明,此神经毒素由121个氨基酸组成,由此计算出的分子量为13,700,与用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得值接近。N末端是门冬酰胺,C末端是丝氨酸。纯化后的神经毒素显示磷脂酶A活性,比活相当于粗毒的11倍。     

蝮蛇突触前神经毒素的纯化及其生化性质的进一步研究

本文在前文的基础上,改进了蝮蛇神经毒素的分离方法,纯化了蝮蛇毒中的两个神经毒素之一,突触前神经毒素Agkistrodotoxin(简写为ATX),并对其生化特性进行了分析。应用DEAE-纤维素柱层析、CM-葡聚糖凝胶柱层析和聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳等方法分离纯化,得到一个均一的神经毒素蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶在pH 碱性和pH 酸性电泳鉴定,都呈现一条区带。氨基酸定量分析结果表明,此神经毒素由121个氨基酸组成,由此计算出的分子量为13,700,与用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得值接近。N 末端是门冬酰胺,C 末端是丝氨酸。纯化后的神经毒素显示磷脂酶A 活性,比活相当于粗毒的11倍。     

兔子宫内膜染色质蛋白与雌二醇受体的结合作用

本文应用亲和层析技术,使兔子宫内膜染色质蛋白偶联于琼脂糖Sepharose 4B,并证明分离的兔子宫内膜染色质蛋白组分C与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用。先分离纯化的核,然后用2MNaCl提取染色质蛋白,并对25mM磷酸缓冲液透析,得到可溶的组分A和不溶的组分B,后者再用0.1NHCl抽提,得到酸可溶的组分C。将各组分偶联于琼脂糖凝胶,测定与雌二醇受体复合物的结合量。结果表明组分C的结合活力最大,故本文主要对它的结合特性进行了研究。固定化组分C的主要结合特性是:(1) 与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用,其解离常数K_d=2.20×10~(-9)M,(2) 其结合活力对离子浓度是敏感的,当增加离子浓度时则减弱,(3) 与雌二醇受体复合物的结合作用能被过量的R·DES复合物有效地抑制,(4) 对25℃温育活化的雌二醇受体复合物有较大的结合量,(5) 经胰蛋白酶处理后即失去结合活力,但不受DNase Ⅰ和RNase的影响,提示在其结合作用中没有核酸参与。     

兔子宫内膜染色质蛋白与雌二醇受体的结合作用

本文应用亲和层析技术,使兔子宫内膜染色质蛋白偶联于琼脂糖Sepharose 4B,并证明分离的兔子宫内膜染色质蛋白组分C与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用。先分离纯化的核,然后用2M NaCl提取染色质蛋白,并对25mM磷酸缓冲液透析,得到可溶的组分A和不溶的组分B,后者再用0.1NHCl抽提,得到酸可溶的组分C。将各组分偶联于琼脂糖凝胶,测定与雌二醇受体复合物的结合量。结果表明组分C的结合活力最大,故本文主要对它的结合特性进行了研究。固定化组分C的主要结合特性是:(1)与雌二醇受体复合物有高亲和力的结合作用,其解离常数K_d=2.20×10~(-9)M,(2)其结合活力对离子浓度是敏感的,当增加离子浓度时则减弱,(3)与雌二醇受体复合物的结合作用能被过量的R·DES复合物有效地抑制,(4)对25℃温育活化的雌二醇受体复合物有较大的结合量,(5)经胰蛋白酶处理后即失去结合活力,但不受DNase I和RNase的影响,提示在其结合作用中没有核酸参与。     

眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

为了得到高纯度眼镜蛇毒细胞毒素-4N,探索眼镜蛇毒中细胞毒素-4N(cytototxin-4N,CTX-4N)对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC-T6)的增殖抑制作用。本研究采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱结合的方法对眼镜蛇毒蛋白进行分离纯化。在每一步分离纯化过程中,采用CCK-8法检测各蛋白峰组分对HSC-T6细胞的增殖抑制作用活性,收集增殖抑制作用最强的CTX-4N峰。经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度,Nano-LC-ESI-MS/MS质谱方法鉴定其组分,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测CTX-4N对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,从而确定其药理作用。经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化后得到一个电泳纯度的蛋白,蛋白质谱鉴定为CTX-4N,分子量约为9.605 k D。不同浓度的CTX-4N作用HSC-T6细胞24 h后,随着其浓度的增大对HSC-T6细胞增殖抑制作用越强,呈剂量-效应关系,IC_(50)为(12.836±0.045)μg/m L。因此,本研究建立一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化方法,并确定了其对HSC-T6细胞的增殖抑制的药理作用随浓度的增加而增强,为进一步研究其药理作用提供一定的理论依据。     

大鼠卵巢促黄体激素/人绒毛膜促性腺激素受体cDNA的克隆和在昆虫细胞中的高效表达

促黄体激素/人绒毛膜促性腺激素受体(LH/hCG receptor)是一种与G-蛋白偶联的糖蛋白。本文报道了从大鼠卵巢cDNA库中筛选LH/hCG受体cDNA及其在昆虫细胞中的高效表达。LH/hCG受体cDNA全长2403bp,编码受体信号肽和成熟受体674个氨基酸。用多角体病毒表达载体pVL1393,LH/hCG受体cDNA在昆虫细胞中得到高效表达。在非还原和还原条件下的SDS-PAGE分析显示,用亲和层析分离纯化的受体表观分子量分别为120Kd和92Kd。经配基结合和Scatchard Plot分析表明,其与hCG反应的Kd为8.4×10~(-9)mol/L,与CHO细胞表达产物相似。     

电鳐β—蝮蛇毒素结合蛋白的抽提及其与毒素结合性质的研究

以加州电鳐电器官为材料,探索了用去垢剂ＴｒｉｔｏｎＸ－１００增溶抽提β－蝮蛇毒素结合蛋白 合适条件,建立了此结合蛋白活性的检测方法,并分析了该结合蛋白与同位素＾１２５Ｉ标记β－ＡｇＴＸ的结合性质。     

番茄凝集素的分离纯化及某些性质的研究

番茄成熟果实经抽提上鸡卵类粘蛋白(OM)-Sepharose 4B亲和层析柱分离纯化制得番茄凝集素。制品在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条带,表观分子量为205,000。Sephadex G200凝胶过滤行为呈单一吸收峰,分子量为180,000。等电聚焦测得等电点为7.6和9.4。它能使人和多种动物红细胞,以及某些培养细胞凝集,但效价不同。N—乙酰葡萄糖胺寡聚糖是其专一性结合糖。     

蝮蛇突触前毒素的结晶及其物化性质的鉴定

江苏和浙江省一带所产的蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒,按前文所描述方法,分离出二个主要神经毒组分。经生理学鉴定其中一个具有选择性地阻断神经肌肉接头突触前传递过程的作用。用等电聚焦板电泳从该组分制备出经聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定为一均一条纹的突触前毒素,定名为蝮蛇神经毒素(agkistrodotoxin),蝮蛇神经毒素对小白鼠(腹腔注射)的最小致死量为每公斤体重55微克,在90℃下保温20分钟毒性不变,用中性连续或碱性不连续SDS 圆盘电泳测定的分子量为13,400,不含亚基,用等电聚焦圆盘电泳测得等电点为6.9,在12℃对34%饱和硫酸铵(pH7.0)透析可得长方形晶体。关于蝮蛇神经毒素的其他生理特性,以及蝮蛇毒中其他神经毒素的纯化和鉴定将在另文发表。