大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活怀表达及在体外酰胺化？…

将大鼠脑ＣＤＮＡ库来源的ＰＡＭ基因片段,经克隆重组,成真核表达质粒ＰＳＶ－ＰＡＭ〈并转染ＣＨＯ细胞,获得在ＣＨＯ中稳定表达活性型α－酰胺化酶的细胞株ＤＧＡＥ。 物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明。以α－Ｎ＿ａｃｅｔｙｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ为底物,该酶催化反应的Ｋｍ为１２．５μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１８０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ,而且催化反应中表现中有最适铜离子浓度     

金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达

这篇文章报道了金黄色葡萄球菌核酸酶A的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在E．Coli中的高效表达。SDS—PAGE分析表明,核酸酶A的含量可占E．Coli细胞总蛋白含量的60%。经有效的增溶和复性处理后,重组酶具有与天然酶相同的活力;N-末端氨基酸分析的结果指出,fMet在转译后被加工去除;对重组SNaseA在构象上的同一性也通过Phenyl—Su—perose疏水柱层析进行了分析。     

肽的α-酰胺化研究进展

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,由酰胺化酶PAM催化完成.PAM是一个双功能酶,含有两个催化结构域：PHM和PAL,顺序催化酰胺化两步反应.PAM的ｍRNA和蛋白质具有多样性.作为活性肽生物合成途径中的限速酶,PAM的表达及活力水平具组织特异性,受激素及发育中的相关因素的调节.     

β干扰素基因在大肠杆菌中的表达

通过Bal 31酶酶切及筛选从β干扰素基因组克隆中分离到成熟β干扰素基因,并组建了一个在Tac启动子控制下表达β干扰索基因的质粒。研究了不同诱导条件对β干扰素表达的影响。Β干扰素在大肠杆菌中表达的产量为10μ／l。     

地衣芽孢杆菌产生碱性蛋白酶的动力学研究

应用自动控制发酵设备,首先进行分批发酵试验摸索了地衣芽孢杆菌2709生长与代谢的基本规律。然后采用补料分批发酵方法限制生长基质浓度,测定了一系列(S_I,μ_I)、(μ_j,q_pj)数据,获得K_S、μ_max、α、β等参数的值,并且推导出了细胞生长与产物合成的动力学公式,从而证明了用Monod方程描述地衣芽孢杆菌2709生长速率与基质浓度关系的合理性和合成碱性蛋白酶的发酵属于生长部分关联型。     

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFNβ成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαAPIB。pPICZαAPIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFNβ, 其中B1株酵母的PoIFNβ产量最高,约为2.5×10.5U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×10.6U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDSPAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFNβ阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFNβ理论推导分子量（约20.8kDa）大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFNβ对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFNβ对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。     

蜜环菌胞外漆酶的合成、纯化及性质研究

研究了蜜环菌胞外漆酶合成条件和酶学性质。实验表明,培养基初始pH5.5、培养温度25℃有利于菌株产酶;与麦芽糖、山梨糖和半乳糖相比,纤维二糖和棉子糖作为碳源时漆酶产量更高;有机氮源比无机氮源有利于漆酶合成。泥炭提取液可显著诱导漆酶生成,当其含量为50%时,菌株漆酶最高产量是对照组的7倍。在蜜环菌发酵上清液中检测到3个漆酶同功酶组分,其主要活性（约占75%）组份漆酶A经 (NH₄)₂SO₄沉淀、制备级PAGE电泳和阴离子交换柱层析被分离纯化至电泳均一,SDSPAGE法测得酶亚基分子量59kD,凝胶过滤色谱法测定活性酶分子量58kD。纯化的漆酶A等电点pI为4.0,氧化愈创木酚的最适反应pH为5.6,最适温度为60℃,在60℃和65℃时半衰期分别为45min和36.8min,在pH5.2～7.2范围内稳定性较好。100mmol/L Cl^-对该酶有显著抑制作用,1mmol/L SO^2-₄ 对漆酶有激活作用,1mmol/L NaN₃可完全抑制酶活性,10 mmol/L EDTA对漆酶活没有明显影响,1mmol/L Cu²⁺对漆酶有激活作用。以愈创木酚为底物时,测得酶的K_m=1.026mmol/L,V_max=5μmol/(min·mg);以ABTS为底物时,测得其K_m=0.22mmol/L,V_max=69μmol/(min·mg)。     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

结合光谱法在DMIs类杀真菌剂筛选中的应用

为建立一种快捷和准确的方法用于新型杀真菌剂的筛选,以外源表达的稻瘟菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶为靶酶,以市售烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮为DMIs类杀真菌剂代表,分析了靶酶活性、靶酶纯度和靶酶浓度对二者结合光谱的影响,并与生物测试结果比较分析其可靠性。结果表明靶酶的高活性、无其他P450干扰和合适的靶酶浓度是获得准确结合光谱的必要条件。烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮与靶酶结合常数（K,/i>_d）分别为0.143μmol/L、0.24μmol/L、0.257μmol/L、0.307μmol/L,该结果与其对稻瘟菌生长抑制能力(120h-EC₅₀)显著相关,证明结合光谱法可作为一种简便可靠的DMIs类杀真菌剂筛选方法。     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

本文研究了海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)β-葡萄糖苷酶的底物特异性以及不同化学试剂对酶活力的影响。该酶水解对一硝基酚基-β-葡萄糖苷、纤维二糖和水杨素的相对活力分别为100、180和67.3。水解对一硝基酚基β-葡萄糖苷和纤维二糖的Km值分别为0.97mmol／L和1 8mmol／L,Vmax分别为576μmol min-1.mg-1和595μmol.min-1.mg-1.mg-1。Ag+、D-葡萄糖和纤维二糖对酶活力有强烈的抑制作用。Lineweaver—Burk作图法及Dixon作图法表明D-葡萄糖对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki值分别为30mmol／L和3．4mmol／L。     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

小球藻病毒基因调控序列在大肠杆菌和真核藻中的调控活性研究

以小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因(amt)和主要外壳蛋白VP54基因的5′上游调控序列构建大肠杆菌和真核藻转化载体。以P_RP_L及CaMV35S启动子为阳性对照,研究了小球藻病毒来源的两种调控序列在E.coli和真核藻细胞中的启动活性。发现P_AMT在4种E.coli菌株中都具有极强的调控活性,启动Luc基因表达而产生的酶活性高于P_RP_L 50～400倍;P_VP54在DH5α中也具有较强的启动活性。同时PAMT在两种小球藻中启动GUS基因瞬时表达的能力也明显高于CaMV35S启动子,表明它们有可能在真核藻类遗传转化中具有很好的应用前景。     

产α-淀粉酶的米曲霉菌株筛选及产酶条件的研究

从51株米曲霉(Aspergillus oryzae)中筛选到5株产α-淀粉酶活力较高的菌株,对其中的5037号菌株进行了产酶条件的试验:最适培养温度为30—33℃,时间为2.5天,3天以后酶活力开始下降;pH3.5—6.0之间对产酶活力影响均不大;外加碳源以糊精和瓜干粉较好,其中玉米粉加量以5%最好;外加氟源中NH₄NO₃和尿素等对酶的形成有促进作用;NH₄Cl抑制酶的形成。在最适产酶条件下,酶活力平均达438.8u/ml。     

利用杆状病毒载体在棉铃虫血细胞中表达大肠杆菌β－半乳糖苷酶

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体pAc36O－B－gal与野生型的苜蓿丫纹夜蛾(AcNPV)DNA同时转染草地夜蛾细胞,经x—gal筛选和空斑纯化得到重组型杆状病毒AcNPV－β－gal。该重组病毒能有效地感染棉铃虫血细胞系,并高效表达出受AcNPV多角体蛋白启动子控制的、具有生物活性的外源基因产物－－β－半裂糖苷酶。80％以上的酶蛋白能分泌到细胞外,培养液中酶活可达每毫升50000单位以上,约相当于170μg酶蛋白。用要SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达产物和β－半乳糖苷酶在凝胶上的特异性显色反应分析,重组病毒在棉铃虫血细胞中表达的AcNPV多角体蛋白－－大肠杆菌β－半乳糖苷酶融合蛋白是以5种活性的多聚体或复合物形式存在的。     

植物细胞离析酶的制备和应用

用 Aspergillus sp．A-19菌经固体发酵研制成一种新的植物细胞离析酶(SeparatasezA—P)。其离析单细胞的酶活力平均为70 767u／g,有效作用的pH在3．0—7．0,温度为20—45℃。发酵培养基配方是麸皮：桔皮粉：(NH₄)₂SO₄(w／w)为100:100:O．63,料水比为1 :2．0,培养适宜条件为25℃、60小时。     

葡萄糖氧化酶产生菌Z—l—C的分批发酵与恒化培养

本文对葡萄糖氧化酶产生菌z—I—c的分批发酵与恒化培养进行了研究。实验发现,在以葡萄糖为生长限制性基质的恒化培养中,该产生菌的维持系数为O．04 g葡萄糖／g菌体．H,生长得率系数Y^max_G=O．714 g菌体／g葡萄糖,最大比生长速率μmax=O．385h^-1,饱和常数Ks=4．76g/L,理论最适稀释度Dm=0．260h^-1,最大酶比活(E／x)max为2．16×10³μ／mg,其值较分批发酵的最大酶比活(1．5l×10³μ／mg)提高43％。当向恒化培养的补料培养基中添加0．02％的α-甲基-D-葡萄糖时,由于该葡萄糖结构类似物的诱导作用,可使(E／x)max达3．11×10³μ／mg,较分批发酵之值提高106％。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体P64a。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9 个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southern blot 检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。 实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。     

人修饰型降钙素和鼠酰胺化酶基因在昆虫细胞中的偶联表达

人降钙素 (hCT)是 32氨基酸的多肽激素 ,C-端为α脯氨酰胺结构 ,具有调节体内钙、磷代谢等许多重要生理功能。用重组昆虫杆状病毒表达系统 ,偶联表达合成的人修饰型降钙素 (hmCT)基因与GST融合基因和大鼠酰胺化酶 (PAM)基因 ,再用抗hmCT或抗PAM抗体 ,既检测到由昆虫细胞表达的GSThmCT产物也检测到PAM产物。经GSH 琼脂糖凝胶亲和层析 ,分离纯化GSThmCT融合蛋白。这种蛋白修饰酶与底物在真核细胞偶联表达也将适用于其他生物活性肽的体外表达