人胱硫醚β-合酶及其截短型片段的表达、纯化和活性测定

将人胱硫醚β-合酶(CBS)基因克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得的重组质粒pGEX-4T-1-CBS转入大肠杆菌E.coli Rosetta (DE3)菌株,构建了高效表达CBS的重组菌E.coli Rosetta (pGEX4T-1-CBS)。重组菌在0.1mmol/L的IPTG于30℃诱导16h,可溶性CBS表达量达到28mg/L培养基。将重组菌破碎后上清液经GSTrap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBS融合蛋白,在凝血酶柱上切割缓冲液中加入3%甘油和0.1%CHAPS可以有效抑制酶切后CBS聚沉,酶活性回收率为54.8%,蛋白质产率为15.2mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为143U/mg,终浓度为1mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)可使CBS单位酶活提高5.1倍,达到735U/mg。同时构建了表达CBS_1-413(删除了CBS羧基端调控域138个氨基酸残基)的重组菌E.coli Rosetta (pETDuet-1-CBS_1-413),经过一步HisTrap Fast Flow亲和层析,酶活性回收率为74.3%,蛋白质产率为12.8mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为965U/mg; 还表达和纯化了胱硫醚β-裂解酶(CBL),并在此基础上建立了一种新的CBL偶联的CBS酶活性测定方法。     

Enterobacter cloacae Z0206细菌胞外多糖的体外抗氧化活性研究

本实验旨在对Enterobacter cloacae Z0206菌进行发酵培养,以制备胞外多糖,并对其体外抗氧化活性进行初步研究。通过产多糖菌E.cloacaeZ0206的深层发酵制备细菌胞外多糖,在此基础上对其清除DPPH自由基、超氧阴离子、抑制羟自由基的能力以及还原力等四个方面进行实验,评价其抗氧化活性。结果表明,深层发酵制备的E.cloacaeZ0206胞外多糖产量为6.62g/L,其在5mg/mL时对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别达到61.57%和40.08%。提示E.cloacaeZ0206细菌胞外多糖具有显著的抗氧化能力,具有开发为抗氧化类食品或药品的潜力。     

银杏种仁中抗菌蛋白的纯化及性质

银杏果仁提取上清液经硫酸铵沉淀、CM—52离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶过滤层析后分离纯化出一种抗菌蛋白。SDS—PAGE分析结果表明,此蛋白分子量为13000,对热稳定;氨基酸组分分析表明,该蛋白含18种不同氨基酸,尤富含丙氨酸(Ala)和精氨酸(His)等,缺乏半胱氨酸(Cys);纯化的蛋白对黄瓜镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)、瓜类炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)等真菌有很强的抑制作用,而且对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia Coli)等细菌也有一定的抑制作用。     

硫化氢合成酶抑制剂金丝桃素的体内外抗结肠癌作用研究

为研究金丝桃素对硫化氢合成酶活性的影响,探索金丝桃素作为胱硫醚-β-合成酶(CBS)抑制剂的体内外抗结肠癌作用。本研究通过亚甲蓝法测定金丝桃素和氨基氧乙酸(AOAA)对CBS产H2S活性的抑制作用,以HT29人结肠癌细胞和移植HT29细胞的裸鼠肿瘤模型为抗肿瘤研究对象,测定金丝桃素体内外抗肿瘤作用。结果表明,来源于贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)的化合物金丝桃素是CBS的高效选择性抑制剂,其IC50为7.9±1.42μmol/L。金丝桃素能显著抑制HT29人结肠癌细胞的增殖,其IC50为22.2±2.25μmol/L。基因沉默实验表明CBS蛋白可能是金丝桃素在细胞内的潜在靶标之一。意外的是,目前普遍使用的CBS抑制剂AOAA抑制HT29细胞增殖作用非常弱,其IC50为152.5±35.68μmol/L。此外,不同剂量的金丝桃素(5~30mg/kg·d)均能显著减少裸鼠肿瘤体积和重量,30mg/kg·d剂量皮下给药2周后,和对照组相比肿瘤重量减少了68%。以上结果表明金丝桃素作为CBS的选择性抑制剂具有显著的抗结肠癌作用。     

少根根霉(Rhizopus arrhizus)脂肪酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从少根根霉中扩增出脂肪酶基因(包括前导序列和成熟肽),并将其连接到酵母分泌表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115。利用抗生素G418从重组阳性克隆中筛选得到高拷贝的转化子。在5 L的发酵罐中,当碳源耗尽后开始流加甲醇诱导脂肪酶的表达,经过96 h培养后发酵液上清液中重组脂肪酶(rRAL)的表达量约为90 mg/L。rRAL经过超滤,SP-Sepharose离子交换层析和Butyl-Sepharose疏水层析纯化。纯化后的蛋白在SDS-PAGE上为单一条带,表观分子量为32 kDa,比酶活为1 543 U/mg。N-端序列分析表明rRAL是经过加工后的产物。同时没有发现全长的Rhizopus arrhizus脂肪酶(RAL)被分泌表达。     

绞股蓝多糖体外抗氧化活性研究

研究绞股蓝多糖的单糖组成及抗氧化活性.采用气相色谱(GC)分析绞股蓝多糖的单糖组成,通过体外抗氧化评价体系研究绞股蓝粗多糖(GPMPP)和精制多糖(GPMP)的总还原力、清除DPPH自由基、羟自由基的活性以及抗脂质过氧化作用.结果显示,绞股蓝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,物质的量比为1.39∶3.76∶1.00∶1.64∶4.98∶5.88.绞股蓝多糖具有较好的还原能力,对DPPH自由基和·OH具有较强的清除能力,并且对小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化和Fe2+-H2O2诱导的小鼠肝匀浆脂质过氧化具有较好的抑制作用.以上结果表明,绞股蓝多糖具有明显的抗氧化活性.     

绞股蓝多糖提取分离、化学结构及生物活性的研究进展

绞股蓝是我国特色天然资源,近年来研究发现多糖是其重要的药用活性成分,具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖、抗疲劳等生物活性。更重要的是绞股蓝多糖不仅具有显著的抗肿瘤活性,还参与和介导了免疫功能的调节,能够提高机体免疫功能而对正常细胞没有毒副作用,在恶性肿瘤、艾滋病等威胁人类健康疾病的防治和治疗方面具有广阔的应用前景,有希望开发成我国特色的创新药物。本文对绞股蓝多糖分离纯化、结构以及生物活性等方面进行详细综述,为以后进一步研究提供理论参考。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的组成型表达、产物纯化及鉴定

将大肠杆菌(E.coli K12) S 腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因克隆至质粒pBR322中,获得的重组质粒pBR322-SAMS转入大肠杆菌JM109菌株，构建了能高效组成型表达SAMS的重组菌E.coli JM109 (pBR322-SAMS)。将重组大肠杆菌破碎后上清液经20%~40%硫酸铵分级盐析、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析和Q Sepharose Fast Flow离子交换层析,即可得到纯度提高5倍，比活为48.7 μ/mg的SAMS，三步纯化的总回收率为62%，纯度达到92%。SAMS表达量为1 176μ/L，占到菌体可溶性总蛋白的20%。重组酶的最适反应pH为8.5，4℃下在pH 7.5的缓冲液中保温10h酶活性几乎不改变。重组酶反应的最适温度为55℃ ，酶活性稳定的温度范围为20~35℃。重组酶的KmL Met为0.22mmol/L，Vmax L-Met为1.07mmol/(L·h)，Km ATP为0.52 mmol/L，Vmax ATP为1.05 mmol/( L·h)。