蛋白质组分析中蛋白质分步提取方法的建立

利用细胞裂解液充分溶解细胞蛋白质是成功进行蛋白质组分析的先决条件.尝试利用三步提取法,即以三种溶解性能不同的裂解液分步提取细胞中的蛋白质组,并分别进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-D PAGE）分离.通过对2-D PAGE蛋白质图谱的比较,发现其与常规方法相比,具有蛋白质提取率高、双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分辨率高等优点.     

重组人绒毛膜促性腺激素嵌合肽12的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备

利用板状聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)方法 ,建立了一步分离纯化基因工程表达蛋白质的新技术。在构建的人绒毛膜促性腺激素嵌合肽 (CP1 2 )表达率约为 1 %的情况下 ,借助分析制备两用型板状PAGE装置 ,通过下行和上行两次电泳以及用透析膜隔离形成收集槽这两步改进 ,从包涵体抽提液中一步纯化了目的表达产物。结果表明 ,一次上样总蛋白质量为 3～ 4mg的PAGE ,可获得 5 0～ 1 0 0 μgCP1 2蛋白 ,其相对均一性达到 95 %。研究提示此改良的制备性PAGE新技术 ,是一种分离纯化低分子量目的蛋白质的好方法     

小分子肽的Tricine-SDS-PAGE分离方法

在蛋白质的生化分析和基因表达产物的分离纯化中 ,经常要把某种或某些蛋白质成分分离开来。聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS- PAGE)是分离蛋白质的常用生化方法 ,样品的蛋白质分子热变性解聚后与 SDS结合形成带负电的蛋白质 - SDS复合物 ,复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小 ,使用均匀浓度的 SDS-PAGE来分析分子量在 15～ 2 0 0 k D的蛋白质时 ,电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。但常规定 Tris-甘氨酸 -盐酸系统中电泳分离分子量小于 10 k D的多肽效果差。作者在分离小分子肽的实验中改进了一套较简便的分离小分子肽的 T…     

尿素改善SDS-PAGE分离小分子肽的效果

目的：探讨尿素对Tricine—SDS—PAGE系统分离小分子蛋白的影响。方法：利用常规SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE分离小分子肽,比较不同组成的分离胶的分离效果。结果：调整聚丙烯酰胺凝胶的分子组成,使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度为5．05％,能够改善小分子肽的分离效果。加入36％的尿素比加入甘油可以更有效分离1kD的小肽。但尿素胶聚合太快影响分离效果。结论：尿素改善SDS—PAGE分离小分子肽的效果,制作尿素胶时,宜采用低浓度的AP和TEMED使凝胶慢速聚合。     

有效分离1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法

为了建立能有效分离 1kDa的特小分子肽的Tricine SDS PAGE方法 ,调整分离胶中聚丙烯酰胺凝胶的分子组成 ,使致密胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的交联度为 5 %,并加入 36 5 %的尿素 ,用于分离小至 1kDa的小分子肽 ,并与常规的SDS PAGE和先前报道的Tricine SDS PAGE相比较。结果改进的致密胶可以有效分离分子量小至 1kDa的小肽 ,明显优于常规的SDS PAGE和现有的Tricine SDS PAGE方法。     

荧光标记IgHV1抗原九肽及其分离纯化

目的 :建立IgHV₁抗原九肽荧光标记及分离纯化的方法。方法 :利用硫代磷酸化的原理以荧光试剂标记IgHV₁抗原九肽 ,用葡聚糖凝胶 (Sephadex)G 1 5层析柱及聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对荧光标记的IgHV₁抗原九肽进行分离纯化并以毛细管电泳技术进行鉴定。结果 :用毛细管电泳技术对纯化后样品进行鉴定 ,其电泳图谱只出现单一峰。结论 :初步建立IgHV₁抗原九肽荧光标记及分离纯化的方法     

新生大鼠顶盖脑组织提取液的生化分析——Phast System电脑快速电泳

本文用Phast System电脑快速电泳仪,对新生大鼠顶盖提取液进行了分离和自动染色。结果:(1)20％自然PAGE显现25条蛋白带;(2)经微浓缩器10、30处理后的SDSPAGE显现19条;(3)10—15％梯度自然PAGE显现30条;(4)IEF 3—9电泳显现52条,其中约85％是酸性蛋白质。顶盖提取液中蛋白的分子量主要介于14KD和100KD之间。此外,对自动染色作了比较。     

水稻种子贮藏谷蛋白的微细异质性

利用灵敏的等聚焦与SDS－PAGE合的双向电泳分析方法,从水稻（Oryza sativa L.)种子贮藏谷蛋白中至少可以分离为13条酸性和19条碱性多 肽,依据谷蛋白多肽的表现量推测,水稻谷蛋白主要由约6个主效基因控制,肽图谱与N－端氨基酸序列分析可清晰将谷蛋白酸性多肽分为两组,此两组恰好与谷蛋白GluA和GluB两个cDNA克隆组相吻合。     

九香虫血淋巴及其纯化蛋白抑菌活性的研究

对九香虫AsporgopuschinensisDallas血淋巴及其血淋巴蛋白质分离物的抗菌活性进行了研究,抗菌活性检测指示菌为大肠杆菌Escherichiacoli和金黄色葡萄球菌Staphilocalliesacereus。测定结果表明,九香虫血淋巴及其离心上清液都具有明显的抗菌活性。用凝胶过滤法从血淋巴蛋白分离提纯获得一种小分子肽,SDS PAGE电泳为单一带,分子量约为1～1 4 4kD。该小分子蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌作用,与血淋巴对2种细菌的抗菌性一致,表明其是九香虫血淋巴中具抗菌作用的主要物质之一。     

人肺腺癌细胞A—549和正常细胞HBE的蛋白质组差异分析

为了研究人肺腺癌细胞A 5 49和正常细胞HBE的蛋白质组差异 ,用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人肺腺癌细胞系A 5 49和正常细胞HBE的总蛋白质 ,银染显色 ,PDQuest 2 DE软件分析 ,对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PeptIdent软件查询SWISS PROT数据库。结果获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱 ,图象分析探测到A 5 492 DE图谱的平均蛋白质点数为 (890± 38)个 ,HBE的平均蛋白质点数为 (75 7± 2 7)个 ,不同胶间蛋白质点的位置偏差在IEF方向为 (2 .85± 0 .48)mm ,在SDS PAGE方向为 (2 .6 9± 0 .37)mm。差异表达分析发现A 5 49和HBE图谱有5 35个蛋白质点相互匹配 ,其中A 5 49有 35 5个未被匹配 ,HBE中有 2 2 2个未被匹配 ;对A 5 49和HBE中的 18个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析 ,经数据库查询 ,初步鉴定为一些与物质代谢、细胞因子、信号转导有关的蛋白质。提示人肺腺癌细胞A 5 49和正常细胞HBE的蛋白质组具有差异 ,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究肺腺癌的相关蛋白质及分子标记物     

AspC基因导入前后E.coli BL21蛋白质组的解析

为了考察表达天冬氨酸转氨酶工程菌在转基因前后蛋白质水平的差异变化,采用固相pH梯度-SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对转基因前后的大肠杆菌（E．coli BL21）的总蛋白进行分离,银染、显色后,使用2D蛋白质图象分析系统Image Master 2D Platinum 5．0和SWISS-2D PAGE蛋白质组数据库对双向电泳图谱进行分析,识别了近600个蛋白点,比较分析了与苯丙氨酸合成途径相关的关键蛋白的差异,初步探讨了AspC基因的导入后大肠杆菌蛋白质水平的精细调控。     

用~(125)I标记肽图估计近年来流行的甲型流感病毒血凝素的变异率

将一种灵敏而简便的~(125)Ⅰ标记肽图分析方法用于估计近年来流行的5株甲1型和S株甲3型流感病毒血凝素(HA)的变异率。经计算这两种亚型病毒HA的年平均氨基酸变异率分别为0.47％和0.44％。但在1986年分离株与1985年分离株之间则有较大的变化,对HA的变异率与流行病学资料的关系进行了讨论。     

完整弓形虫P35重组蛋白IgM-酶联免疫吸附测定法检测弓形虫急性感染

为利用重组的完整弓形虫表面抗原P35 GST蛋白对弓形虫感染进行血清学诊断 ,构建了可表达P35 GST的JM10 9细胞株 .采用亲和层析对融合蛋白进行分离和纯化 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹 (Westernblot)分析所表达的蛋白质 ,并用纯化的重组蛋白进行IgM 酶联免疫吸附测定法 (IgM ELISA)检测不同病人血清中的抗 P35抗体 .SDS PAGE分析发现P35 GST重组蛋白的大小约 6 0ku ,为一亲水性蛋白 ,蛋白质印迹分析表明该蛋白与弓形虫阳性感染病人的血清有特异性反应 .利用P35 GST为抗原 ,对 6 0例血清进行IgM ELISA分析 ,发现P35 GST可明显区分近期感染和既往感染 ,在弓形虫的诊断上有很大的应用前景 .     

蛋白质组研究中肽质量指纹谱鉴定方法的建立及应用

建立了用肽质量指纹谱和数据库检索方法鉴定凝胶电泳分离蛋白南的方法。用标准蛋白质对胶上蛋白５质原位酶切制备肽谱的方法进行了讨论。分析了实际细胞蛋白质样品,获得双向电泳分离的人肺癌细胞蛋白质谱中三个蛋白质点的肽指纹谱。并通过数据７库检索分别鉴定为甘油醛－３－磷酸脱氢酶－２,测在蛋白羟基末端水解同工酶和丙糖磷酸异构酶。     

一种结合生物医学知识的蛋白质组非标记定量分析方法及其应用

基于质谱的非标记定量方法能够对复杂蛋白质组进行规模化分析,同时,在定量分析的基础上理解和解释蛋白质组的功能和相互作用关系更有意义.这需要建立一种有效的兼容定量和定性分析结果的方法.针对这一需求,本文首先借鉴了NSAF(normalized spectral abundance factor)算法采用肽段计数对蛋白质组数据进行定量,进一步结合共享肽对该方法进行优化.以此为基础,通过g:Profiler获取海量蛋白质组的功能注释信息,在定量分析的过程中,同步实现了对蛋白质组数据的功能性分析.本文选择来自人心脏、小鼠心脏、小鼠肝脏的三组线粒体蛋白质组数据对该方法进行验证,按照功能性分析将三组数据划分为若干功能组或信号通路,并进行相关性、功能聚类以及电子传递链分析.结果表明,结合共享肽的优化算法克服了对低丰度蛋白质的错误估计,提高了非标记定量的准确性.同时,结合生物医学知识的分析方法解释了蛋白质组的功能和相互作用关系,为差异比较蛋白质组学、疾病蛋白质组学以及功能蛋白质组学等组学研究提供了新的方法.     

蛋白质组研究中分离新技术与新方法

对于蛋白质组的研究离不开分析技术的支撑。由于样品及其基质的复杂性,为了实现蛋白质的高通量、高灵敏度、快速分析鉴定,必须发展与之匹配的新技术与新方法。多维高效液相色谱/毛细管电泳技术,部分弥补了传统2D PAGE的不足,近年来,在蛋白质分离鉴定方面取得了最令人瞩目的成绩。本文分别从多维液相色谱分离技术、多维毛细管电泳蛋白质分离平台、微柱液相-毛细管电泳联用技术、极端pH蛋白质的分离分析和蛋白质的在线富集技术等方面对蛋白质组学研究中在新技术与新方法方面近期取得的成果加以系统阐述。     

猪与人甲_3型流感病毒的比较研究——Ⅰ、抗原性及多肽结构分析

比较1978、81、82年从猪中分离出的甲_3流感病毒与同年代人甲_3流感病毒的抗原性及多肽结耕。从血清学、血凝素肽图以及SDS-PAGE电泳图都表明逐年猪甲_3与人甲_3血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)抗原性密切相关。而且膜蛋白与核蛋白也基本相同。更明确表明人的甲_3流感病毒年年不断地极易传给猪。猪中有了甲_3病毒株其NP迁移位置与其它毒株略有不同,文中对此进行了讨论。用~(125)I标记血凝素肽图比较1979、1981、1982、1983年猪与人甲_3毒株,逐年在肽图上都有明显差异,同年不同时间分离的毒株之间,肽图上也略有改变,更进一步表明此法的灵敏性。     

基于数据非依赖采集的以肽为中心分析算法和软件的研究进展

数据非依赖采集(data-independent acquisition,DIA)是一种高通量、无偏性的质谱数据采集方法,具有定量结果重现性好,对低丰度蛋白质友好的特点,是近年来进行大队列蛋白质组研究的首选方法之一。由于DIA产生的二级谱是混合谱,包含了多个肽段的碎片离子信息,使得蛋白质鉴定和定量更加困难。目前,DIA数据分析方法分为两大类,即以肽为中心和以谱图为中心。其中,以肽为中心的分析方法鉴定更灵敏,定量更准确,已成为DIA数据解析的主流方法。其分析流程包括构建谱图库、提取色谱峰群、特征打分和结果质控4个关键步骤。本文综述了以肽为中心的DIA数据分析流程,介绍了基于此流程的数据分析软件及相关比较评估工作,进一步总结了已有的算法改进工作,最后对未来发展方向进行了展望。     

亲和层析法分离鉴定人类端粒酶复合体及其蛋白质组分分析

为分离纯化人类端粒酶复合体并对其蛋白质组分进行分析 ,自行设计一套特异的以端粒重复序列为配体 ,以亲和磁珠为介质 ,以竞争性碱基序列为洗脱原则的寡核苷酸亲和纯化法 ,对He La细胞端粒酶复合体进行分离纯化 .并采用近年发展起来的主要用于检测序列特异性 DNA结合蛋白的凝胶迁移阻滞分析法对纯化产物进行鉴定分析 .应用 SDS- PAGE对纯化蛋白质亚基组分进行分析与鉴定 ,并采用电泳迁移率和已知蛋白质分子质量标准的对数作图分析测得所得蛋白质亚基成分的相对分子质量 .结果表明 ,纯化产物以 TRAP法检测酶活性可见典型的梯形条带 ;比活性为每 mg蛋白质的 cpm值为 1 80× 1 0 9,纯化倍数 1 80 0 ,得率 90 % .凝胶迁移阻滞法分析显示特异的凝胶迁移阻滞性电泳条带 ;以 SDS- PAGE检测得到 4种蛋白质亚基成分 ,其蛋白质相对分子质量分别为 2 2 0 ku、2 1 2 ku、1 1 6ku和 43ku.由上述可见 ,采用自行设计的寡核苷酸亲和纯化法获得了人端粒酶复合体及 4种蛋白质亚基组分 .     

质量肽谱在蛋白质结构研究中的应用

蛋白质的一级结构始终是生物学家关心的一个焦点,他们通常使用肽谱分析的方法测定蛋白质的一级结构。肽谱是一种技术,它使用特异性的酶或化学的方法,将蛋白质降解成小肽,然后进行分离和分析[1]。肽谱在蛋白质研究中起着重要的作用,它可以确证蛋白质的序列,用于蛋白质鉴定;鉴定翻译后的修饰及体外的化学修饰;检测单个氨基酸的变异(即突变);鉴定不同的蛋白构型;也可用于产生核苷酸探针检测ＤＮＡ文库;合成多肽诱导...