枯草芽孢杆菌B2菌株产生的表面活性素变异体的纯化和鉴定

利用6mol/L HCI沉淀枯草芽孢杆菌B2菌株的去细胞培养液,甲醇抽提获得脂肽类抗生素粗提物,过Sephadex LH-20层析柱获得粗纯化物,经MALDI-TOF-MS检测表明B2菌株仅含有表面活性素一种脂肽类抗生素。利用HPLC SMART SYSTEM,将粗纯化物过μPRC C2／C18层析柱对表面活性素变异体进行分离后获得纯化物。经MALDI-TOF-PSD—MS对纯化物的结构分析表明,B2菌株的表面活性素变异体由13、14和15个碳原子的脂肪酸链以及L-Glu-L-Leu—D—Leu—L-Val-L-Asp-D—Leu-L-Leu七环肽组成。     

脂肽-糖脂混合生物表面活性剂产生菌筛选和优化培养

结合脂肽和糖脂的性能优势,致力于产脂肽-鼠李糖脂混合型生物表面活性剂的新菌株选育和培养条件优化。采用血平板溶血圈法初筛菌株、改进排油圈法快速检测产量以及飞行时间质谱鉴定产物结构。对优选菌株的碳源、氮源和磷酸盐缓冲液、重要金属离子浓度等进行了单因子和正交试验,优化了培养基和培养条件。采用高压液相色谱和蒽酮比色法定量分析了产物组成。筛选获得了同时积累糖脂和脂肽的新菌株,鉴定命名为芽胞杆菌Bacillus subtilis THY-7。摇瓶分批培养48 h,细胞OD600为37.0,产物浓度2.4 g/L,分别是优化前的3.4倍和3.1倍。发酵罐补料分批培养,泡沫中产物浓度达到4.5 g/L,且74％为表面活性素,22％为鼠李糖脂。B. subtilis THY-7是具有脂肽-鼠李糖脂高产潜力的优选菌株。     

地衣芽胞杆菌FJAT-4脂肽结构鉴定及其对尖孢镰刀菌的抑制作用

【目的】地衣芽胞杆菌FJAT-4产生的脂肽能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长,本研究的目的在于探究地衣芽胞杆菌FJAT-4脂肽结构,分析培养基组分和培养温度对FJAT-4产抑菌脂肽的影响,阐述脂肽对尖孢镰刀菌的抑制作用,为菌株抑菌机理的阐释及其在枯萎病防治中的推广应用奠定基础。【方法】通过酸沉醇提法提取地衣芽胞杆菌FJAT-4产生的脂肽;利用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱进行地衣芽胞杆菌FJAT-4脂肽组成分析及结构鉴定;以抑菌圈大小为指标评估地衣芽胞杆菌FJAT-4脂肽对尖孢镰刀菌的抑制效果;通过扫描电镜观察地衣芽胞杆菌FJAT-4粗脂肽对尖孢镰刀菌的抑制作用。【结果】地衣芽胞杆菌FJAT-4产生的抑菌脂肽由C_(17)fengycin A、C_(17)fengycin B、C_(17)fengycin B_2、C_(16)fengycin A衍生物、C_(16)fengycin B衍生物、C_(13)–C_(15)surfactin及C_(13)–C_(15)surfactin衍生物组成,其中C_(13)–C_(15) surfactin衍生物(m/z[M+Na]~+=1048.6/1062.6/1076.6)为新化合物。培养基成分不同对菌株FJAT-4脂肽组成影响较小,但温度对菌株FJAT-4产生抑菌脂肽的影响很大,该菌株在较低温度(20–25°C)下培养不产生脂肽,30–40°C下培养能产生抑菌脂肽,且高温有利于提高脂肽中surfactin的比例。该脂肽类物质对辣椒、番茄、香蕉和甜瓜尖孢镰刀菌等多种植物病原真菌均具有很好的抑制效果,且呈剂量依赖性。扫描电镜结果表明地衣芽胞杆菌FJAT-4所产的脂肽会严重影响辣椒、番茄、香蕉和甜瓜尖孢镰刀菌菌丝的正常生长,导致菌丝断裂变形、孢子变形或显著抑制了孢子的生长。【结论】地衣芽胞杆菌FJAT-4产生的抑菌脂肽为fengycin和surfactin类物质,该抑菌脂肽会致使尖孢镰刀菌菌丝体发育畸形,影响尖孢镰刀菌的正常生长。     

枯草芽孢杆菌JA产生的脂肽类抗生素－iturin A的纯化 及电喷雾质谱鉴定

枯草芽孢杆菌JA产生的抗生素对植物病原真菌具有广谱抗性,明确抗生素的种类是进一步研究的基础.用6mol/L盐酸沉淀JA菌株的去菌体培养基,再用甲醇抽提获得抗生素的粗提物.利用反相HPLC系统,将粗提物过Diamonsil C18柱,收集有抗小麦赤霉病等病原真菌活性的化合物1、2.运用电喷雾质谱法(ESI/MS)测得其分子量分别为1042.4D和1056.5D.再利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片,结果表明分子量为1042.4D的化合物一级结构为Pro-Asn-Tyr-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln(βAA为14个碳原子的氨基脂肪酸),属于脂iturin A.化合物1、2为相差一个亚甲基(-CH2)的iturin A同系物.研究结果提供了一种从枯草芽孢杆菌发酵液中快速分离纯化和鉴定脂肽类抗生素iturin A的新方法.     

解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌脂肽芬芥素的分离鉴定及抑菌作用

对一株解淀粉芽孢杆菌TF28产生的抗菌脂肽进行分离鉴定及抑菌活性研究,采用酸沉淀、乙酸乙酯和甲醇萃取技术制备了抗菌脂肽粗提物,经过2次HPLC分离纯化,在保留时间32～42min内获得8个抗菌脂肽纯品,经MALDI-TOF-MS鉴定为芬芥素(fengycins),对尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌显示出较强的抑菌活性,该研究为提高菌株TF28抗菌脂肽产量的定向遗传改造奠定基础。     

芽胞杆菌产生的脂肽类抗生素的结构和应用

脂肽类抗生素不仅对细菌、真菌有抗菌作用,而且对支原体、寄生虫和病毒等也具有显著的抑制作用。其主要包括表面活性素(Surfactins)、伊枯草菌素(Iturins)和芬芥素(Fengycins),其中Iturins和Fengycins有抗真菌活性,Surfactins有抗支原体、抗病毒等活性。综述了芽胞杆菌产生的脂肽类抗生素的结构、功能和应用,为其在农业和医药的研究与应用提供参考。     

枯草芽胞杆菌B006产表面活性素的培养条件优化

芽胞杆菌产生的环脂肽类生物表面活性素surfactin具有重要抗菌、促进生物膜形成等功能,其含量和同系物组分构成影响其功能。为了提高芽胞杆菌B006产生表面活性素的产量,通过单因素实验和正交实验,测定了碳源、氮源和无机盐等营养物质及接种量、培养时间、装液量和初始pH值对芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的影响;采用排油圈法测定发酵液中表面活性素的产量,采用HPLC-MS方法比较培养基优化前后surfactin的产量和组分含量。结果表明,适合芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的培养基组成为:牛肉膏10 g/L、玉米粉15 g/L、硝酸铵3 g/L和氯化钠3 g/L;适合的培养条件为:初始pH值7.0、接种量10%、装液量60 m L/500 m L,发酵周期64 h。优化后surfactin的产量约为314.73 mg/L,比优化前提高了74.88%;surfactin各组分比例发生改变,其中C16和C17组分的含量明显提高,为优化前相应组分含量的1.64和8.34倍。优化的培养基组分和培养条件可明显提高芽胞杆菌B006菌株产生surfactin的产量,改变surfactin同系物组分的构成,为利用芽胞杆菌B006进行高活性表面活性素的工业生产和代谢调控研究奠定了基础。     

纳豆芽孢杆菌Bna05菌株产抗霉脂肽的鉴定

【目的】分析枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种Bna05菌株代谢产物中脂肽类物质的存在情况,并探讨它们在抗霉功能中所发挥的作用。【方法】利用特异性引物对Bna05菌株进行脂肽合成酶类基因片段扩增、测序和BLAST比对分析;通过平板抑菌圈区域取样法获得Bna05菌株的高抗霉活性代谢产物,对该产物进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离;用琼脂微稀释法测定分离物的抗霉活性,并对活性分离物进行质谱鉴定。【结果】Bna05菌株含有sfp和srf AA基因,未检测到itu C、itu D、fen D、fen ACE、bym B、bym C基因;RP-HPLC分离得到3组抗霉活性物质F_2、F_3和F_4,F_2中未检测到脂肽类物质,从F_3和F_4中分别鉴定出两类Surfactin同系物:V_7-surfactin和I/L_7-surfactin。两类Surfactin分别与F_2组合使用时,均表现出抗霉协同作用;此外,与Surfactin单独使用相比,两类Surfactin混合物与F_2组合后的协同抗霉活性得到进一步增强。【结论】Bna05菌株所产脂肽类物质主要是V_7-surfactin和I/L_7-surfactin,Surfactin与Bna05菌株所产其它活性物质之间存在抗霉协同作用,而V_7-surfactin和I/L_7-surfactin的同时存在,对于增强这种协同抗霉作用是有利的。     

可可西里低温适生拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定及脂肽化合物分析

极端环境特殊微生物资源研究和开发具有广阔的应用前景和研究意义.对分离筛选自青海可可西里境内植被根围的8株在4和10 ℃条件下生长良好的低温适生芽孢杆菌进行鉴定分析.结果表明: 通过生理生化特征分析、rep-PCR指纹图谱分析、16S rDNA及gyrB基因序列分析鉴定,8株供试菌株分别为莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)3株,解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)1株和简单芽孢杆菌(B. simplex)4株.采用平板对峙试验从中筛选到4株对油菜菌核病原真菌(Sclerotinia sclerotiorum)及水稻白叶枯病原细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)均具有显著拮抗活性的生防菌株;采用MALDI-TOF-MS质谱分析生防菌株的拮抗活性物质,结果显示菌株KKD-1 (B. mojavensis)产生脂肽类化合物泛革素和表面活性素,菌株KKD-2(B. amyloliquefaciens)产生脂肽类化合物伊枯草菌素A、泛革素和表面活性素,推断生防菌株的拮抗活性可能与脂肽化合物的合成及分泌有关.该研究为低温适生性芽孢杆菌生物肥料和生物农药的研发提供了菌株资源.     

可可西里低温适生拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定及脂肽化合物分析

极端环境特殊微生物资源研究和开发具有广阔的应用前景和研究意义.对分离筛选自青海可可西里境内植被根围的8株在4和10℃条件下生长良好的低温适生芽孢杆菌进行鉴定分析.结果表明:通过生理生化特征分析、rep-PCR指纹图谱分析、16S rDNA及gyrB基因序列分析鉴定,8株供试菌株分别为莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)3株,解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)1株和简单芽孢杆菌(B.simplex)4株.采用平板对峙试验从中筛选到4株对油菜菌核病原真菌(Sclerotinia sclerotiorum)及水稻白叶枯病原细菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)均具有显著拮抗活性的生防菌株;采用MALDI-TOF-MS质谱分析生防菌株的拮抗活性物质,结果显示菌株KKD1(B.mojavensis)产生脂肽类化合物泛革素和表面活性素,菌株KKD2(B.amyloliquefaciens)产生脂肽类化合物伊枯草菌素A、泛革素和表面活性素,推断生防菌株的拮抗活性可能与脂肽化合物的合成及分泌有关.该研究为低温适生性芽孢杆菌生物肥料和生物农药的研发提供了菌株资源.     

Brevibacillus brevis HOB1所产脂肽的分离纯化和鉴定

用常压反相色谱对从短短芽孢杆菌HOB1发酵液中提取到的脂肽类生物表面活性剂进行了分离纯化, 并用HPLC制备了其中的一个化合物。经电喷雾质谱分析得到该化合物的相对分子量为1035.7 D, GC/MS的分析结果显示其脂肪酸部分为C15 β-羟基脂肪酸, 由PITC柱前衍生法测得该化合物的氨基酸组成比例为: Asp:Glu:Val:Leu = 1:1:1:4。结果显示该脂肽的结构与表面活性素(C15 surfactin)类似。实验表明, 除芽孢杆菌属外, surfactin系列脂肽还能为短芽孢杆菌属所产生。     

原生质体融合选育高产脂肽LI-F多粘类芽胞杆菌及融合菌株表达差异分析

本研究以多粘类芽胞杆菌JSa-9前期诱变获得的两株带有营养缺陷型标记的菌株N1-37(Phe–)和N2-27(His–)作为亲本菌株,采用聚乙二醇作为促融剂,进行原生质体融合,筛选出高产LI-F类抗菌脂肽的融合菌株。通过HPLC对融合菌株和原始菌株产LI-F类抗菌脂肽进行定量检测,并利用实时荧光定量PCR对菌株JSa-9和融合菌株中LI-F类抗菌脂肽合成酶的关键基因fus A1、fus A2、fus C1和fus C2的差异性表达进行分析。结果表明,经过原生质融合获得一株LI-F类抗菌脂肽高产菌株F5-15。菌株F5-15的LI-F类抗菌脂肽产量为原始菌株产量的3.1倍,LI-F类抗菌脂肽合成酶的4个关键基因在融合菌株F5-15中的表达量分别是其在原始菌株JSa-9中的10.48、2.48、2.1和11.8倍。     

原生质体紫外诱变选育高产抗菌脂肽菌株及其活性物质的研究

本研究以实验室自主分离的枯草芽孢杆菌mutHS-301为出发菌株,通过原生质体紫外诱变选育出高产抗菌脂肽突变菌株,并对其产生的抗菌脂肽提取物进行单组分分离纯化及对黄曲霉抑制作用进行初步研究。结果表明,在溶菌酶浓度为0.5 mg/mL,酶解时间为15 min,酶解温度为37℃条件下,获得原生质体的形成率和再生率效果最佳。采用紫外照射时间60 s进行该原生质体诱变,经筛选获得一株遗传性状稳定的高产抗菌脂肽菌株,命名为mutHS-539。研究表明,该突变株mutHS-539发酵上清液对副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌抑菌直径较原始菌mutHS-301分别提高了21.49%和21.05%,提取得到的抗菌脂肽产量较原始菌提高了40%。利用制备型硅胶板对发酵提取物进行分离纯化得到四种组分,分别为a、b、c和d;进一步检测对黄曲霉的抑菌活性,结果发现只有组分d对黄曲霉具有显著的抑制作用。经RP-HPLC分析及液质联用数据比对,该组分d的主要成分为杆菌霉素D。该抗菌脂肽提取物对黄曲霉抑制作用的研究显示,当抗菌脂肽浓度为0.2 mg/mL时能有效抑制黄曲霉菌丝的生长,抑制率达到了74.22%,且对黄曲霉孢子的致死浓度为0.8 mg/mL。     

一株产脂肽类表面活性剂的碱性Dietzia菌及特性研究

【目的】筛选降解性能良好的产生物表面活性剂的菌株,对其进行分类学鉴定,确定所产表面活性剂物质并对各影响因素进行评价。【方法】利用液体石蜡为底物筛选降解性能良好的产生物表面活性剂菌株,通过形态特征观察、生理生化测定、16S rRNA基因序列分析等实验确定菌株的分类地位。通过排油圈活性、表面张力值、薄层层析等方法确定生物表面活性剂的性质,分析碳、氮源和温度、pH、盐浓度各因素对菌株产生物表面活性剂的影响。【结果】从大连新港采集的样品中分离得到一株产表面活性剂的嗜碱菌株3372,经分类鉴定表明其是Dietzia cercidiphylli的新菌株。嗜碱菌3372发酵液粗提物的排油直径为6.1 cm,表面张力可从67.62 mN/m降到32.95 mN/m,经薄层层析分析,初步鉴定为脂肽类表面活性剂。综合各因素对发酵液表面活性的影响,菌株3372在pH为9.0、适盐浓度为3%的培养基中,经30°C培养可将发酵液表面张力值降到最低。【结论】嗜碱菌3372是脂肽类生物表面活性剂产生菌的新成员,其在高盐碱条件下产生表面活性剂的特性在工业应用上有一定的潜力。     

人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达

利用基因工程表达的方法,在大肠杆菌中通过与GST蛋白融合的方式高效表达了胸腺素α1前体基因,随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式,得到了胸腺素前体肽段31肽和N端未经乙酰化修饰的28肽。融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的35%～40%,样品肽的产量也达到了约200mg/L（肽/发酵液）的产量。经质谱测定,分子量分别为3366和3066。BalB/C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明,所构建的GSTTα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用,其中N端未经乙酰化的28肽产物与31肽产物活性相近,均对淋巴细胞具有明显的刺激增殖作用。     

产表面活性素和伊枯草菌素A菌株的筛选及其脂肽类产物的特性

采用血琼脂平板法, 从菜园土壤中分离到8株代谢表面活性剂的菌株, 比较各菌株的排油性、抑菌性, 根据合成脂肽类物质表面活性素(Surfactin)和伊枯草菌素A (Iturin A)必需的sfp、ituD和lpa-14基因设计引物, 结合PCR的方法筛选到一株具广谱抗菌性且含有sfp、ituD和lpa-14 3个关键基因的细菌XZ-173。经过生理生化试验测定和16S rDNA序列系统发育学分析, 将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过红外光谱(FT-IR)分析该菌株代谢产物, 初步鉴定为脂肽类物质, 并对照高效液相色谱(HPLC)与标准品比对结果, 确定含有Surfactin和Iturin A组分。该菌株产生的脂肽粗品能使纯水的表面张力降低至26.6 mN/m, 临界胶束浓度(CMC)为500 mg/L, 具有很好的乳化性能, 对立枯丝核菌和青枯菌表现出很好的拮抗活性。因此, 产脂肽细菌XZ-173是一株应用前景广阔的功能菌。     

培养基中铁离子对枯草芽孢杆菌CICC 23659发酵产脂肽的影响研究

高性能的生物表面活性剂脂肽在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域具有广泛的应用价值.利用高效液相色谱法和电喷雾质谱法分析了Bacillus subtilis CICC 23659所产脂肽的组成,结果表明其所产脂肽是由surfactin的同系物C13、C14和C15组成,其分子量分别为1008、1022和1036.以生物量、脂肽产量、脂肽组成、乳化能力和临界胶束浓度等指标考察在培养基中投加不同浓度的Fe2+对B.subtilis CICC 23659的影响,结果表明添加Fe2+不仅能够提高B.subtilis CICC 23659的生物量,还能大幅提高脂肽产量.当Fe2+添加浓度为5 mmol/L时,生物量达到最大3.69g/L,提高了6倍,脂肽产量也达到最大234.08 mg/L,提高了9.5倍.Fe2+作用下脂肽同系物中C13、C14、C15在脂肽产物中的相对含量发生了变化,脂肽同系物C13和C15的相对含量降低,脂肽同系物C14的相对含量上升.脂肽同系物中C13的相对含量越高,CMC值越大,脂肽同系物中C14和C15的相对含量越高,CMC值则越小.     

贝莱斯芽孢杆菌抗真菌能力及基因组分析北大核心CSCD

蛋白水解酶及脂肽类化合物具有广谱的抑菌活性,这些抑菌活性蛋白及物质拥有巨大的研究和开发潜力。本研究通过蛋白水解酶平板筛选到一株对6种不同病原真菌有较明显抑菌效果的菌株,命名为X49,对该菌株进行理化分析,并由16S rRNA基因测序、API测试和电镜分析鉴定菌种,进一步分析其基因组序列,再利用偶氮酪蛋白方法分析蛋白水解酶活性及提取脂肽类化合物进行抗真菌测试。结果表明,该菌株在10–50℃、pH 4.0–9.0范围内均可以生长,对环境盐浓度的适应性较强,在10%NaCl浓度下仍然能够生长。菌种鉴定发现X49菌株属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。基因组分析则显示,B. velezensis X49菌株有11个编码的丝氨酸蛋白酶,其基因编号1_894属于S8枯草杆菌蛋白酶家族,与已知具有抗真菌能力的丝氨酸蛋白酶有高达99%的相似度。另外有多达30个编码的非核糖体肽合成酶,其中包含参与合成已知的表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、杆菌肽及短杆菌肽脂肽类化合物。胞外蛋白水解酶活性分析发现其在高温下仍具有一定的活性。将B. velezensis X49菌株与中药干姜共发酵后,提取出的脂肽类化合物,其抑菌功效大大提高。由此可见,本研究筛选出的B. velezensis X49菌株对于植物及人类病原菌都有很显著的抑制作用。而与中药共发酵的活性物质可作为未来药物的研究开发。     

整合素αMβ2 I-结构域的基因合成和蛋白表达

目的：利用大肠杆菌表达系统表达整合素αMβ2 I-结构域,并对其进行纯化。方法与结果：利用DNAWorks在线引物程序设计经过密码子优化的整合素αMβ2 I-结构域的寡核苷酸序列;采用PCR介导的基因拼装法合成αMβ2 I-结构域DNA模板,将其克隆至原核表达载体pET11d-6h上,并转化大肠杆菌,获得表达菌株;经IPTG诱导,αMβ2 I-结构域在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化后,纯度达到90％以上;电喷雾电离质谱测定表明纯化所得的蛋白精确的相对分子质量为23720.0,与预期值相符;肽指纹质谱图谱鉴定其为目的蛋白。结论：αMβ2 I-结构域的高效表达,为进一步研究其与配体的结合及其复合物晶体结构奠定了基础。     

黄曲霉拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens B10-6-1产生的脂肽类抗生素的分离和鉴别

本文旨在对黄曲霉拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens B10-6-1的脂肽类抗生素相关基因进行克隆,对其所产生的脂肽类抗生素进行组分分离,对有抑菌活性的脂肽类抗生素进行结构鉴别。以解淀粉芽孢杆菌B10-6-1基因组DNA为模板,采用PCR方法对ItuA、ItuB、ItuC、ItuD、FenA、FenB、FenD、Sfp、bmyA、bmyB、bmyC合成基因进行DNA扩增。将该菌发酵液经过离心、酸沉淀、甲醇抽提等步骤得到脂肽类抗生素的粗提物,采用高效液相色谱法分离,对收集的洗脱峰组分进行体外抑菌试验,对有抑菌活性的组分进行液质（HPLC-ESI-MS）分析。PCR扩增检测结果显示黄曲霉菌拮抗菌B10-6-1能扩增出ItuA、ItuC、ItuD、FenA、FenD、Sfp、bmyA、bmyB、bmyC合成基因,未能扩增出ItuB、FenB合成基因。高效液相色谱法收集到7种组分,体外抑菌试验证明组分5和7有抑菌活性。经液质测定,组分5和组分7分别为脂肽类抗生素C₁₄Bacillocnycin D和C₁₅Bacillocnycin D。本研究探明了黄曲霉菌拮抗菌B10-6-1所产生的天然抑菌活性成分,为该菌用于黄曲霉菌的生物防治奠定了理论基础。