低温产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及纤维素酶学性质

[目的]筛选一株低温产纤维素酶菌株并进行鉴定,初步探索其酶学性质,为微生物肥料生产筛选菌种资源.[方法]常温条件下,采用CMC-刚果红染色法初筛纤维素降解菌株.采用低温条件诱导的方法,筛选耐低温且产纤维素酶能力最强的菌株,经形态学、生理生化特征试验、ITS序列等方面分析系统分类地位.单因素试验确定温度、pH及金属离子对纤维素酶活力的影响.[结果]从秸秆还田土壤中分离出一株在13℃低温环境下高效分解纤维素的真菌M11,鉴定M11为草酸青霉(Penicillium oxalicum).发酵试验表明:以玉米秸秆粉为唯一碳氮源,13℃、200 r/min摇床发酵培养9d时,纤维素酶活力最高为33.08 U/mL.对其酶学性质初步研究表明:该酶最适pH为5.0,最适反应温度为20℃,在5℃-20℃间酶活力仍能保持在90％以上.[结论]Penicillium oxalicum M11是一株高效的纤维素降解菌株,在低温条件下可分泌纤维素酶且活性显著,具有潜在的开发价值.     

解淀粉芽孢杆菌MN-8对玉米秸秆木质纤维素的降解

微生物降解木质纤维素既是生物质资源化利用中的关键问题,也是亟需解决的难点问题.本文在前期获得木质素降解菌——解淀粉芽孢杆菌MN-8菌株的基础上,进一步研究该菌株对玉米秸秆木质纤维素的降解作用.研究利用玉米秸秆粉-MSM培养基对MN-8菌株进行固态发酵,监测发酵过程中木质纤维素酶活力和木质纤维素含量变化情况,并通过傅立叶红外光谱(FTIR)和气质联用色谱(GC/MS)对木质纤维素的降解情况及产物进行分析.结果表明:解淀粉芽孢杆菌MN-8菌株可产生木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶等木质纤维素降解酶,在发酵10～16 d陆续达到酶活力峰值,最高酶活力分别为55.0、16.7、45.4和60.5 U·g-1.发酵24 d后,玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素的降解率可分别达到42.9％、40.6％和27.1％.FTIR光谱数据表明,玉米秸秆发酵后木质素、纤维素和半纤维素的特征吸收峰强度均有一定程度的下降,表明木质纤维素被部分降解.GC/MS分析结果也证实,解淀粉芽孢杆菌MN-8能有效降解秸秆木质纤维素.MN-8菌株可断裂玉米秸秆木质素单体之间的连接键β-O-4,将秸秆木质素解聚为苯丙胺、苯丙酮和苯丙酸等保留木质素苯丙烷结构的单体化合物,并将部分单体化合物进一步氧化为Cα羰基化合物,如2-氨基-1-苯丙酮和紫丁香基苯乙酮等.在对纤维素和半纤维素降解产物的GC/MS分析中发现,降解产物包含葡萄糖、甘露糖和半乳糖等多种单糖化合物以及甲酸、乙酸、丙酸、1,1-乙二醇和3-羟基丁酸等代谢产物.表明解淀粉芽孢杆菌MN-8对秸秆木质纤维素表现出强降解作用,且该作用依赖于菌株产木质纤维素降解酶的能力.     

枯草芽孢杆菌BS-26菌株纤溶酶的性质分析及活性组分的分离纯化

[目的]溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段,从微生物中寻找溶栓药物是一种理想有效的途径,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-26菌株发酵液具有很强的体外纤溶活性,本文分析了发酵液中纤溶酶的性质并对活性组分进行了分离纯化.[方法]利用纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性,利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰胺制备电泳等方法,进行分离纯化.[结果]此菌株产生的纤溶酶在50℃以下和pH5.0～11.0范围内具有较好的稳定性,最适作用温度为42℃;最适pH值为9.0;Mg2 、Ca2 对此酶有明显的激活作用,而Cu2 能完全抑制酶的活性;174.2μg/mL的苯甲基磺酰氟、1000μg/mL的鸡卵类粘蛋白和1000μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂能完全抑制酶活性,初步说明此酶属于丝氨酸蛋白酶类;体外溶纤作用表明,该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原.从该菌株的发酵液中获得了一种纤溶酶组分,比活力达8750 U/mg,回收率为3.2%,所获得样品纯度相对于发酵液提高了41倍,该酶在SDS-PAGE中是单肽链蛋白,分子量为32 kDa.[结论]获得了一种纤溶酶的单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化及进一步研制和开发新的溶栓药物提供重要理论依据.     

黄曲霉拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens B10-6-1产生的脂肽类抗生素的分离和鉴别

本文旨在对黄曲霉拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens B10-6-1的脂肽类抗生素相关基因进行克隆,对其所产生的脂肽类抗生素进行组分分离,对有抑菌活性的脂肽类抗生素进行结构鉴别。以解淀粉芽孢杆菌B10-6-1基因组DNA为模板,采用PCR方法对ItuA、ItuB、ItuC、ItuD、FenA、FenB、FenD、Sfp、bmyA、bmyB、bmyC合成基因进行DNA扩增。将该菌发酵液经过离心、酸沉淀、甲醇抽提等步骤得到脂肽类抗生素的粗提物,采用高效液相色谱法分离,对收集的洗脱峰组分进行体外抑菌试验,对有抑菌活性的组分进行液质（HPLC-ESI-MS）分析。PCR扩增检测结果显示黄曲霉菌拮抗菌B10-6-1能扩增出ItuA、ItuC、ItuD、FenA、FenD、Sfp、bmyA、bmyB、bmyC合成基因,未能扩增出ItuB、FenB合成基因。高效液相色谱法收集到7种组分,体外抑菌试验证明组分5和7有抑菌活性。经液质测定,组分5和组分7分别为脂肽类抗生素C₁₄Bacillocnycin D和C₁₅Bacillocnycin D。本研究探明了黄曲霉菌拮抗菌B10-6-1所产生的天然抑菌活性成分,为该菌用于黄曲霉菌的生物防治奠定了理论基础。