Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6d为病毒在细胞内的增殖高峰期。     

肾综合征出血热双价纯化疫苗（Vero细胞）病毒株的筛选及其免疫原性研究

选用在Vero细胞上初步适应的LR1（Ⅰ型）、R22（Ⅱ型）株病毒,经乳鼠脑或腹腔接种,收剖感染鼠脑并在Vero细胞传代适应,此收获病毒与直接以Vero细胞传代的病毒比较表明：抗原效价、毒力滴度有明显提高。用LR1、LR22株病毒感染的Vero细胞培养物制备单价粗制疫苗和双价精制纯化疫苗免疫家兔,经空斑减少中和试验检测中和抗体,结果表明经乳鼠和Vero细胞交替传代适应后的LR1、R22株病毒具有良好的抗原性和免疫原性。     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLCMK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性

从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。     

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞,连续传代,检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞,通过连续带毒传代至第7代,病毒滴度可达6.78 lg LD50/mL,并在第10~15代内滴度维持在7.0 lg LD50/mL以上,15~30代滴度稳定在7.0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液,各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)的要求,疫苗效力在6.0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。     

甲型肝炎病毒H2快速复制株在人二倍体细胞中的增殖研究

研究甲型肝炎病毒H₂快速复制株在人二倍体细胞中的生长特性,并缩短甲肝病毒的培养周期。将甲型肝炎病毒H₂株感染人二倍体细胞（KMB17细胞株）,采用高病毒感染复数（MOI）将病毒培养时间从26d缩短至10d后收获病毒,并通过连续传代进行适应研究,建立H₂株快速复制毒种库,在不同培养时间检测病毒抗原、感染性滴度,绘制病毒生长曲线,进行传代稳定性验证和病毒形态学的观察。甲肝H₂株快速复制病毒株在KMB17细胞上培养10d后收获,连续传代从第5代至第9代,抗原含量均在512～2 048之间,感染性滴度均在8.33 lgCCID₅₀/mL±0.125lgCCID₅₀/mL,H₂株快速繁殖至5代病毒和9代病毒在电镜下观察到多为成熟的实心颗粒。在5批次的重复试验中,病毒培养至10d、16d、22d时,收获的病毒感染性滴度无显著差异（P>0.005）。筛选后的甲型肝炎病毒H₂株的快速复制株缩短了甲肝病毒的培养时间,且保持较...     

脊髓灰质炎病毒减毒株Sabin 3经型间嵌合在人胚肺二倍体细胞(KMB17)上的适应性研究

为筛选Sabin 3型人胚肺二倍体细胞新适应株,将原来在体外培养过程中对KMB17细胞适应较差的Sabin 3型病毒与适应较好的Sabin 1型病毒混合培养11代,经噬斑筛选81个克隆后,感染性滴度检测表明,大部分筛选的克隆感染性滴度较低,仅33号克隆滴度最高,达8．125LgCCID50／ml。经全基因序列分析发现,该克隆(Sabin 3．33)为Sabin 1型和Sabin 3型的型间嵌合株,其中5’NCR为Sabin 1型,其余区域与Sabin 3型相同。经型别鉴定为Sabin 3型,与毒力直接相关的位点5’NCR的第480位核苷酸及位于VP2的第2034位核苷酸都未发生变异,表明已初步获得一株人胚肺二倍体细胞：KMB17的新适应株。     

登革病毒对人血管内皮细胞感染性的研究

用登革病毒Ⅱ型（DV2）感染体外培养和传代的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,研究发现,HUVEC是登革病毒的允许性细胞。病毒感染后12h即可在培养上清中用微量蚀斑法测出病毒,病毒滴度48h达高峰,以后迅速下降。并发现在一定范围内病毒产量随病毒感染复数（MOI）的增加而增高。间接免疫荧光法证明感染的HUVEC胞浆及胞膜上携带DV2抗原。电镜和光镜下,感染细胞未见明显的形态和结构改变。     

地鼠肾细胞培养的CTN株狂犬病新疫苗研究

应用细胞毒种代替豚鼠脑毒种制备狂犬病地鼠肾细胞纯化疫苗。将狂犬病毒CTN株在原代地鼠肾细胞（PHKC）传代适应,用病毒培养液上清作为生产用毒种,结果通过在PHKC传10多代,适应后病毒滴度达到了7.0LogLD50/ml,并应用适应株（CTN－LS－HK）细胞毒种制备三批疫苗,其效力在6.11-6.55IU/ml,高于用aG株豚鼠脑毒种制备的三批疫苗效力（3.77-5.85IU/ml)。     

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。     

人轮状病毒的细胞培养分离

用CV-1细胞从急性腹泻病儿7份粪便标本中直接分离出4株人轮状病毒(HRV),并适应传代14代。感染细胞出现特征性细胞病变,经电镜、ELISA、免疫荧光染色及病毒RNA电泳等试验证实HRV毒株在CV-1细胞中的繁殖及抗原特异性。病毒滴度为10~(6.0)TCID_(60)。分离的4株HRV毒株均为RNA电泳型长型,经CV-1细胞传7～14代后,RNA图型与原粪样相比未见变异。     

一株人源性轮状病毒的分离及适应性培养

目的:研究轮状病毒野毒株的分离方法、组织培养适应条件及相应生物学性质.方法:对收集的样品采用胶体金、PCR、PAGE进行轮状病毒定性检测.阳性样品按常规方法处理并进行组织培养分离,对不同传代样品做基因组图谱、基因序列、病毒增殖动力学分析评价,采用轮状病毒P[8]G1型阳性血清进行病毒中和鉴别试验.结果:通过检测为A组轮状病毒,基因组为4∶2∶3∶2排列,基因分型G1P [8]型,在MA104细胞中传代后转至Vero细胞上适应培养可观察到CPE;电镜观察可见典型轮状病毒形态.毒株在Vero细胞上增殖到第10代,复制稳定,且感染性滴度达到7.25 log CCID50/ml,增殖高峰为96h.中和鉴别试验证实病毒培养液只包含轮状病毒,无其他病毒污染.结论:从腹泻样品中分离得到一株人源轮状病毒毒株,命名为ZTR-68株,该分离株具有良好的组织培养适应性,遗传稳定性,为进一步研究其生物学性质和疫苗制备提供了基础.     

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。     

呼吸道合胞病毒Long株的培养及应用

建立可稳定收获高滴度RSVLong株病毒的培养方法 ,所获得的RSVLong株病毒液用于RSV抗体ELISA检测。RSVLong株病毒 33℃传至 4代后 ,病毒滴度升高 ,出现典型的细胞病变。以RSVLong株病毒液作抗原所建立的ELISA试剂盒能检测出RSV特异性抗体。     

肾综合征出血热Vero细胞疫苗毒种的选育及生物学特性研究

在肾综合征出血热(HFRS)疫苗Vero细胞毒种研制中,将肾综合征出血热(HFRS)病毒PS-6(Ⅰ型)、L99(Ⅱ型)在Vero细胞上连续传代,并对其病毒滴度、免疫原性、传代稳定性等进行检测。结果显示,两株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8.5 lgCCID50/m l,免疫原性检查,将病毒灭活制成疫苗免疫家兔的血清中和抗体效价>1:10,其他检测符合规程要求。因此,适应的PS-6(Ⅰ型)和L99(Ⅱ型)毒种可用于制备Vero细胞出血热疫苗。     

甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)快速繁殖株不同代次全基因序列比较

为探索甲型肝炎减毒活疫苗 (H2株 )细胞适应的分子机制 ,将甲型肝炎减毒活疫苗毒株(HAVH2K7)在人胚肺二倍体细胞KMB17上快速连续系列传代增强适应 ,繁殖周期由原来的 2 8d缩短为 14d ,连续传代后抗原滴度和感染性滴度不断增加 ,传至 2 2代抗原滴度达 1∶10 2 4 ,感染性滴度lgCCID50 (每ml)为 7 83 .分别将第 6代和第 2 2代病毒用AC PCR法和PCR法扩增 .扩增片段分别与pGEM T载体连接得到重组质粒 ,测定cDNA插入片段的序列 .对 2个不同代次全基因序列及氨基酸序列比较分析表明 ,HAVH2K7适应至第 6代时 ,整个基因组有 6个核苷酸变异 ,全部位于编码区内 ,变异率为 0 0 7% ,导致 3个氨基酸变化 ,分别位于VP2 (A S) ;2C(N H) ;3A(R C) .适应至第 2 2代时 ,整个基因组出现 18个核苷酸突变 ,变异率为 0 2 4 % ,13个是该代次产生的 ,变异最大区域 5′端非编码区 (5′UTR)有 5个核苷酸变异 .编码区突变导致 7个氨基酸变化 ,其中 4个氨基酸变化是该代次在 6代基础上特有的变异 (2C ,Q P ;3A ,A S ;3C ,T A ;3D ,V G) .2C区是编码区变异最多区域 ,共有 4个核苷酸突变 ,在 6代变异基础上出现 3个新突变 ,导致 1个氨基酸变异 .说明 5′UTR的2C区变异对病毒的翻译效率、感染性滴度提高具有重要作用 .     

用人胚肺二倍体细胞株分离一株甲型肝炎病毒

自甲型肝炎患者粪便中分离到一株甲型肝炎病毒(TZ-84)。病毒不产生细胞病变,胞浆中有颗粒性荧光。细胞中的病毒抗原能被抗甲肝病毒抗体阳性血清所中和。 TZ-84株病毒耐酸,耐乙醚。免疫电镜见有大量直径27～30mm的甲肝病毒颗粒,以空心为主。将其接种细胞后的黑暗期随传代而缩短,病毒滴度则随传代而增加。将细胞粉碎后获得的病毒。ELISA滴度为1:16。用其检测45份人血清中抗HAV-IgM抗体,并与Abbott ELISA药盒比较,符合率为91.1％,敏感度为87.1％。     

水痘减毒活疫苗(VZV84-7株)病毒培养时间优化

目的:优化水痘减毒活疫苗(VZV84-7株)的病毒培养时间。方法:按固定MOI区间0.001~0.01感染细胞;从病毒培养70h起,以5h为间隔分5组收获病毒,采用蚀斑法对病毒收获物进行病毒滴定,通过比较,获得滴度较高病毒收获物的培养时间;再根据此时间以1h为间隔分5组进行实验,用显微镜观察记录病变量及病变细胞情况,采用蚀斑法测定病毒收获物滴度。结果:病毒培养70~90h时,随病毒培养时间的延长,病变量和病毒收获物滴度出现先升高后降低的现象,分别在培养80h和85h时获得较高滴度的病毒收获物;病毒培养82~86h时,病变量和病毒收获物滴度差异不明显。结论:病毒培养时间在82~86h间能获得滴度较高的病毒收获物。     

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI) 0. 01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384～448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化; HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。     

甲型肝炎病毒Vero细胞适应株的选育研究

将甲肝患者粪便中分离的甲型肝炎病毒在Vero细胞中进行适应性培养 ,选育高滴度适应株应用于甲肝灭活疫苗研究。在Vero细胞上连续传代 ,测抗原滴度和感染性滴度 ,满意后按WHO推荐的甲型肝炎灭活疫苗规程进行灭活疫苗试制研究。经Vero细胞 14次适应性传代后 ,病毒抗原滴度可高达 1∶2 5 6 0 ,感染性滴度为 8.2 3LogC CID50 /ml。试制的灭活疫苗HPSEC检测在 2 80nm时仅有一个高峰 ,SDS PAGE电泳 ,在 2 2kD、2 6kD和 33kD处有三条蛋白带 ,和HAVVP3、VP2和VP1的位置相同。ICR小鼠效力试验表明疫苗剂量 16 0 0EU/ml与Merck疫苗5 0U效果相似。通过研究获得了Vero细胞甲肝病毒适应株YN5株 ,初步证明可作为甲型肝炎灭活疫苗的候选毒株。