Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(AcTPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ac×Ds的杂交组合354个.检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性.结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4%.检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中.在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7%.对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制--转座和不完全切离等现象.获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录.探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略.     

冠突曲霉产孢相关基因的克隆及功能分析

为探究冠突曲霉有性产孢调控的相关机制,从已构建的T-DNA随机插入突变体库中选取有性产孢突变株,采用Southern杂交鉴定T-DNA为单拷贝插入,并用Tail-PCR技术扩增获得T-DNA插入位点侧翼序列,分离获得突变基因。序列分析表明,该基因位于冠突曲霉基因组scaffold 7上,开放阅读框2 511 bp,含有4个内含子,预测编码666个氨基酸,含有NDT80_Pho G蛋白质超级家族保守结构域。BLASTp结果表明,该预测蛋白与Eurotium rubrum p53-like转录因子(EYE95652.1)相似性最高,identity=89%。显微观察发现T-DNA的插入影响了有性产孢结构的发育。本实验为进一步研究该基因在有性产孢过程中的分子功能及可能参与的调控途径奠定基础。     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.     

水稻无蜡质叶片突变体wcl1的图位克隆

从水稻T-DNA插入突变体库中筛选获得1份叶片表皮无蜡质的突变体wcl1(Wax Crystal-Sparse Leaf 1),突变体wcl1有如下主要特征:一是突变体叶片角质层蜡质减少,二是突变体的干旱敏感性高于野生型。通过图位克隆技术,克隆了wcl1基因,其编码酮酯酰辅酶A(LOC_OS09g25850),在突变体中LOC_OS09g25850基因的第10个外显子处鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)导致转录提前终止,经分析表明突变体wcl1是一个wsl2基因的等位突变体。     

Ac／Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。     

OsCesA4的等位基因Bc7(t)的精细定位和分离

水稻中已经发现并确认了许多脆秆突变体,本研究利用60Co-γ射线诱变粳稻品种中花11得到一脆秆突变体,命名为bc7(t)。与野生型相比,该突变体除了整个植株变脆、纤维素含量降低约10%外,表型与野生型品种相似。遗传分析表明该突变性状受控于单隐性基因,并将该基因精细定位在第1染色体长臂上8.4kb的区段内,基因注释信息表明该区域仅有一个编码纤维素合酶催化亚基(CesA)的基因,与OsCesA4基因等位。进一步的测序分析发现,在突变体中该基因的第10个外显子和第10个内含子的连接处缺失了7个碱基,导致阅读框改变而不能编码功能正常的蛋白。此外,RNA干涉试验表明,将Bc7(t)基因敲除,得到的所有转基因植株表现出类似突变体的脆性。OsCesA4新等位基因的发掘有助于阐明水稻细胞壁的生物合成机理,本文同时也讨论了该突变体用作动物饲料的潜在利用价值。     

水稻矮秆基因iga-1的序列变异和表达分析

该研究以水稻矮秆突变体cha-2为材料,对控制其表型性状的iga-1基因进行候选基因筛选,利用基因注释数据库对定位区间进行候选基因预测,通过ORF及其上下游调控区域的测序、序列比对及关键元件分析进行序列变异研究,半定量PCR检测目标基因的表达模式,明确其在基因序列、表达模式的变异,探讨其分子遗传调控机理。结果显示:(1)在隐性核基因iga-1精细定位基础上预测得到3个ORF,其中2个编码dnaJ分子伴侣(含有dnaJ结构域的蛋白),分别是LOC_Os05g26902和LOC_Os05g26926;另外1个为已克隆的水稻矮秆基因RGA1(LOC_Os05g26890)。(2)ORF序列分析表明矮秆突变体cha-2与野生型仅在RGA1基因座存在SNP变异,但未造成氨基酸编码的改变。(3)表达模式分析发现,矮秆突变体cha-2的RGA1基因在种子萌发期、二叶期、四叶期和分蘖期等4个发育时期均不表达,且在‘中花11’、‘石狩白茅’的遗传背景下稳定遗传,均显现出失活状态,初步确定RGA1为iga-1的候选基因。(4)对RGA1基因上游和下游调控转录关键区进行测序结果表明,突变体cha-2存在865bp的大片段缺失,包括第1外显子、部分第1内含子和转录起始上游区域。研究推断,突变体cha-2的矮秆基因iga-1正是没有活性的RGA1基因,其转录关键区域的大片段缺失,导致无法正常转录表达。     

胡萝卜DcPAB基因的分离及其结构与功能分析

运用改进的减法杂交技术分离到胡萝卜Poly(A)结合蛋白基因DcPAB .其cDNA编码区长度为 1 977bp ,编码 6 5 8个氨基酸和 1个终止密码子 .基因组转录序列区长度为 4 6 1 6bp ,包含 9个外显子和 8个内含子 .DcPAB在胡萝卜基因组中为单拷贝基因 .该基因在胡萝卜体细胞胚中特异性表达 ,且其表达活性在调控 解调控前后有明显差异 .体外结合实验表明 ,在大肠杆菌中表达并纯化的DcPAB蛋白具有与oligo(A) 2 0 特异性结合的性能 .酵母突变体互补实验进一步证明 ,该基因可以互补PAB基因缺失的酵母突变体的功能缺陷     

含Ds转座因子的T-DNA在水稻染色体上的分布研究

应用农杆菌介导的方法获得了有Ds因子插入的3000多株水稻转化群体, 用Inverse PCR方法, 从部分独立转化植株中分离了590条含Ds因子的T-DNA插入位点处的右侧旁邻水稻染色体序列. 根据旁邻序列中T-DNA右边界与侧翼水稻序列之间的插入序列的特征可分成6个主要类别, 其中类型Ⅰ是主要类型, 为通常的T-DNA整合, 即T-DNA右边界序列与水稻染色体序列相连, 或者其间插入小于50 bp的序列片段; 类型Ⅱ为T-DNA右边界旁先接T-DNA载体序列, 再与水稻序列相接的重组类型. 340个类型Ⅰ和Ⅱ的旁邻序列通过与已知的水稻染色体序列数据库一致性比较分析, 确定了它们在水稻染色体上的分布位置, 构建了一个Ds因子在水稻12条染色体插入的框架结构. 这340个有Ds因子插入的位点在整个染色体上平均相距0.8 Mb. 分析在第1条染色体上T-DNA(Ds)插入情况显示有21％的频率插入到预测基因的外显子中. T-DNA(Ds)在染色体上分布位置的确定, 使我们可以选择合适的Ds因子插入株作为起始株系, 导入Ac转座酶基因后, 使Ds发生转座, 从而获得新的Ds插入突变株, 为进一步利用Ds转座标签法分离水稻基因创造了条件.     

基于启动子捕获系统的水稻基因的分离

为了分离水稻的基因及其启动子,该实验室构建了T-DNA(GUS)结构的水稻启动子捕获系统,对其中编号为113#、T-DNA单拷贝插入、GUS报告基因为组成型表达的阳性捕获系进行了进一步分析。潮霉素筛选结合GUS组织化学染色获得了T-DNA插入的纯合株(113#-22和113#-26);Inverse法分离得到T-DNA插入位点水稻基因组DNA旁邻序列,测序和BLAST结果表明,T-DNA反方向插在水稻基因组4号染色体预测基因的内含子中;扩增T-DNA插入位点上游2kb左右DNA片段,构建启动子分析质粒转化水稻‘中花11’胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS组织化学染色模式与113#阳性株系一致。结果表明,该预测基因及其启动子是利用启动子捕获系统所捕获到的候选基因。     

水稻叶绿素a氧化酶基因突变体的鉴定及其对氮营养的响应

对从日本获得的水稻Tos17插入突变基因进行了鉴定,并通过PCR技术对其插入位点和纯合体进行了分析和筛选。结果表明,Tos17插入在序列号为DP000086的基因,在此基因反向互补序列的1579bp处,在mRNA序列的第5个外显子区域,是水稻的一个叶绿素a氧化酶基因,而且此基因在单一的铵营养下表达减弱,氮饥饿条件下表达增强。利用Tos17未端和插入位点上下游设计引物进行PCR反应,鉴定到3株纯合突变体株,为进一步研究其功能奠定了基础。     

稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)诱导的水稻早期反应基因ER1的5' 端cDNA片段克隆及序列分析

研究高等生物基因表达与调控的一个重要方面是分离基因的编码区及其上游的调控序列（ＤｅＶｅｅｒ等１９９７）,这需要获得一个基因的ｃＤＮＡ全长及从植物基因组获取全基因。在前文（周建明等１９９９）中曾经分离了稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因ＥＲ１的ｃＤＮＡ片段,但是运用ｍＲＮＡ差异显示技术分离的ｃＤＮＡ片段往往只有近ｍＲＮＡ３’端的一部分,难以反映基因的结构及功能特点,因此,必须进一步分离其５’端的部分才有可能比较全面地了解此基因的特点。ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎ…     

The glutathione-deficient, cadmium-sensitive mutant, cad2–1 , of Arabidopsis thaliana is deficient in γ-glutamylcysteine synthetase

This paper reports that the glutathione (GSH)-deficient mutant, cad2–1 , of Arabidopsis is deficient in the first enzyme in the pathway of GSH biosynthesis, γ-glutamylcysteine synthetase (GCS). The mutant accumulates a substrate of GCS, cysteine, and is deficient in the product, γ-glutamylcysteine. In vitro enzyme assays showed that the cad2–1 mutant has 40% of wild-type levels of GCS activity but is unchanged in the activity of the second enzyme in the pathway, GSH synthetase. The CAD2 locus maps to chromosome 4 and is tightly linked to a gene, GSHA , identified by a previously isolated cDNA. A genomic clone of GSHA complements both the phenotypic and biochemical deficiencies of the cad2–1 mutant. The nucleotide sequence of the gene has been determined and, in the mutant, this gene contains a 6 bp deletion within an exon. These data demonstrate that the CAD2 gene encodes GCS. The cad2–1 mutation is close to the conserved cysteine which is believed to bind the substrate glutamate and the specific inhibitor L-buthionine-[S,R] sulfoximine (BSO). Both root growth and GCS activity of the cad2–1 mutant was less sensitive than the wild-type to inhibition by BSO, indicating that the mutation may alter the affinity of the inhibitor binding site.     

稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因的cDNA片段克隆与序列分析

以稻瘟病菌感染水稻,利用ｍＲＮＡ 差异显示技术分离了稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因ＥＲ１（ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ） 的ｃＤＮＡ 片段。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明,ＥＲ１ 基因在稻瘟病菌侵染水稻叶片６ ｈ 后开始表达,８ ｈ 最强,１０ ～１２ ｈ 开始减弱,１６ ｈ 消失。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明,ＥＲ１ 基因属于水稻基因组。对ＥＲ１ 基因片段（２１９ ｂｐ） 进行了克隆和序列分析。经查询,在ＧｅｎＢａｎｋ 中没有与ＥＲ１ 同源的基因序列。     

水稻基因APRT的克隆及其与温敏核雄性不育的关系

在拟南芥中腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因(APRT)突变导致植株雄性不育.本文首次报道从水稻(Oryza sativa subsp.indica)中克隆了基因APRT(GenBank登录号AY238894),并将其定位于水稻第4染色体的一个BAC克隆(AL606604)的58 000 bp至63 000 bp区域.该基因长4 220 bp(起始密码子至终止密码子),含7个外显子、6个内含子,编码的APRT蛋白长212个氨基酸残基,与其他物种来源的APRT序列存在很高的同源性.与大麦、小麦、拟南芥1型及其2型的该蛋白同源性分别为54.9%、54.9%、49.6%和59.5%.经保守结构域搜索发现该蛋白中存在APRT催化结构域.从DNA、mRNA两个水平分析了该基因与水稻温敏核雄性不育(TGMS)的关系,结果表明:受温度诱导,水稻"安农S-1"APRT基因的表达变化可能与温敏核雄性不育表现型具相关性.