福建一例HAstV-5型星状病毒的全基因组测序与重组分析

为了探究一例福建省检出的HAstV-5型星状病毒2013/Fuzhou/85毒株基因组分子结构特点,本研究采用PCR分段扩增、测序、拼接的方法,获得2013/Fuzhou/85毒株基因组序列全长6 803bp:5’端和3’端均有85bp非编码区;中间3个开放阅读框:ORF1a长2 802bp(86～2 887nt),编码非结构蛋白丝氨酸蛋白酶;ORF1b长1 548bp(2 827～4 374nt),编码非结构蛋白RNA聚合酶;ORF2长2 352bp(4 367～6 718nt),编码结构蛋白衣壳蛋白前体。目前,GenBank中仅有两株HAstV-5型星状病毒全基因组序列:中国辽宁毒株(JQ403108)和巴西哥亚尼亚毒株(DQ028633),2013/Fuzhou/85毒株和中国辽宁毒株核苷酸相似度最高,达94.4%。对该HAstV-5型星状病毒3个开放阅读框分别构建系统进化树,发现ORF1a与HAstV-1(JF327666)相似度最高,ORF1b和ORF2与HAstV-5(JQ403108)相似度最高,提示其有可能存在重组,用Simplot软件进行重组分析,重组位点位于2 741bp,在ORF1a和ORF1b重叠区的上游。本研究中对2013/Fuzhou/85毒株的全基因组测序和重组分析,可以为星状病毒的重组和遗传进化规律研究提供参考。     

狂犬病病毒糖蛋白基因遗传变异研究进展

狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是一种不分节段的单股负链RNA病毒,属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)。狂犬病病毒属基因组长约12 000个核苷酸(nt),从3′端到5′端编码5个结构蛋白:核蛋白(N)、磷蛋白     

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.     

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA2节段序列比较

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的水稻条纹病毒(RSV)2个分离物RNA2全长序列,其长度分别为3506bp和3514 bp.与已报道的日本T和O分离物RNA2序列进行比较的结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,HZ、T和O分离物为一组,组内分离物之间,RNA2的毒义链(vRNA2)及RNA2的毒义互补链(vcRNA2)上的ORF的核苷酸一致性分别为97.2%～98.0%和96.8%～97.1%,5′端和3′端非编码区的序列则完全一致.但HZ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T和O分离物的等长.另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA2及vcRNA2上的ORF的核苷酸一致性分别为95.0%～95.7%和93.9%～94.4%.CX分离物的IR与HZ分离物相比缺失了一段8 nt的片段.5′端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有一个碱基的差异.这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系.此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能.本文还讨论了RSV的分子流行病学.     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

番木瓜环斑病毒华南强株系cDNA文库的构建及其基因组3''''端区域结构的研究

以λ-ZAPⅡ噬菌体为载体,构建了番木瓜环斑病毒华南强株系(PRV-SM)基因组cDNA文库。以PCR扩增的外壳蛋白(CP)基因为探针筛选出阳性克隆。酶谱和序列分析确定,其中两个阳性克隆除重叠部分外为长达2676个核苷酸的基因组3′端区域。其中包括棱内含体蛋白b(NIb)基因的1607个棱苷酸,CP基因的858个核苷酸和基因组3′端非编码区的211个核苷酸(不包括polyA尾巴)。PRV-SM的NIb含有依赖于RNA的RNA聚合酶的8个特征性保守序列,可能是参与基因组RNA复制的核心亚基。与其他株系比较,NIb的氨基酸变化主要集中在其C端和N端。PRV-SM 3′端非编码区有一段28个核苷酸的正向重复序列,能在其内形成茎环二级结构,并且在各株系间具有高度保守性。NIb,CP和3′端非编码区的总的序列比较表明,SM株系与国外报道的其他株系亲缘关系相对较远。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV-Xb)RNA3 cDNA的克隆和序列分析

通过RT-PCR方法,设计两对引物,克隆了黄瓜花叶病毒香蕉株系(CMV-Xb)RNA3,并进行了核苷酸和蛋白质水平上的分析.结果表明Xb株系RNA3全长2205nt,具有两个蛋白编码阅读框架(ORF),其中5'端(97～936nt)编码一个279aa的3a蛋白;3'端(1225～1871nt)编码一个218aa的CP蛋白.5'非编码区域为96nt;基因间隔区(IR)长288nt;3'NR含有324nt.通过与亚组Ⅱ其它株系RNA3核苷酸和所编码产物推导的氨基酸序列分析发现,亚组Ⅱ株系无论在编码区还是非编码区的核苷酸同源性都相对较高;亚组Ⅱ株系在进化过程中具有连续性.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3基因的重组伪狂犬病病毒的构建

猪繁殖与呼吸综合征 (porcinereproductiveandrespiratorysyndrome ,PRRS)是引起怀孕母猪早产、流产、死胎及仔猪呼吸系统疾病的一种新发现的病毒性传染病[1] .该病毒的基因组为单股正链RNA ,约15kb ,含有 8个开放阅读框架 (ORFs) ,ORF1编码病毒非结构蛋白 (依赖RNA的RNA聚合酶 ) ,ORF2 ORF7编码病毒的结构蛋白 .其中ORF3含有 2 6 5个氨基酸 ,编码的GP3蛋白为高度糖基化的结构蛋白 ,有 7个糖基化位点 ,具有免疫原性[2 ,3 ] .目前 ,用于预防PRRS的疫苗主要是弱毒苗和灭活苗 ,虽然都有一定的免疫效果 ,但由于PRRS抗体依赖性…     

丙型肝炎病毒5

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

丙型肝炎病毒5′-非编码区及其结合蛋白的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

1999～2005年我国婴幼儿人杯状病毒腹泻研究

人杯状病毒(HuCV)是世界范围内急性腹泻的重要病原。此文收集我国长春、北京、河北卢龙、兰州、昆明等13个地区1999-2005年5岁以下腹泻患儿检测轮状病毒为阴性的粪便标本4426份,用ELISA和RT-PCR方法检测HuCV,结果表明HuCV检测阳性率为19%(8.3%-38.6%)。对其中151株HuCV PCR产物测序进行核苷酸序列比对构建的系统发生树表明,我国流行的HuCV以诺如病毒(NV)为主(146/151,占96.7%),其中绝大多数为GGⅡ/4基因型(99/146),其它依次为GGⅡ/3(22/146)、GGⅡ/5(8/146)、GGⅡ/6(2/146)、GGⅡ/7(2/146)、GGⅡ/8(2/146)和GGⅠ/2(2/146),札如病毒(SV)共5株,均属SGⅡ。此外有9株NV GGⅡ遗传组毒株,尚不能归入现有基因型,可能为我国特有的新基因型,表明我国流行的HuCV毒株存在很高的遗传多样性。我国婴幼儿HuCV腹泻全年都有发生,但秋冬季(10月-次年1月)有一个发病高峰,病例以6-17月龄组最多,至3岁时超过96%的儿童都感染过HuCV。对我国流行的HuCV不同毒株的地区分布,不同年度HuCV检测阳性率的变化趋势进行了讨论。     

Yellow head virus from Thailand and gill-associated virus from Australia are closely related but distinct prawn viruses.

Corresponding genomic regions of isolates of yellow head virus (YHV) from Thailand and gill-associated virus (GAV) from Australia were compared by RT-PCR and sequence analysis. PCR primers designed from sequences in the GAV ORF1b polyprotein gene amplified the corresponding 577 nucleotide region of the YHV genome. Comparison of the amplified region indicated 85.1% nucleotide and 95.8% amino acid sequence identity. YHV PCR primers designed to amplify a 135 nucleotide product previously described as a YHV diagnostic probe failed to amplify the corresponding product from GAV RNA. However, the cognate GAV sequence for this and another recently reported YHV sequence were located in an upstream region of the ORF1b gene. A comparison of these sequences indicated identities of 83.0 and 80.9% at the nucleotide level and 86.7 and 86.5% at the amino acid level, respectively. The data indicate that GAV and YHV are closely related but distinct viruses for which differential diagnostic probes can be applied.     

猪圆环病毒2型ORF2编码基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR从含有PCV-2的PK-15细胞中扩增出ORF2基因,将其克隆入pSecTag2载体中,构建了pSecORF2载体。又设计一条含信号肽序列的上游引物,以pSecORF2为模板,扩增出含信号肽序列的ORF2基因,将其克隆到pIREShyg载体上,构建了pIRESiORF2真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞,进行表达。间接免疫荧光实验(IFA)成功检测到pIRESiORF2在CHO细胞中的表达。这为进一步研究ORF2编码蛋白的生物学活性及建立PCV诊断试剂盒打下基础。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

香蕉枯萎病菌果胶甲基酯酶基因的克隆与生物信息学分析

旨在了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)4号生理小种(FOC4)PME基因序列特征,根据同源物种PME相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,克隆FOC4序列基因和开放阅读框,命名为Foc4Pme。结果表明,所获得的PME基因均含有2个内含子和3个外显子,990 bp的片段,编码329个氨基酸。预测编码蛋白有信号肽,具有1个功能位点,其分子质量和等电点分为34.894 8 kD和9.17,该蛋白为稳定存在的蛋白。该蛋白疏水性最大值为2.022,最小值为-2.156,大部分区域为亲水区。该基因编码的蛋白具有一定保守性,进化上与镰刀菌亲缘关系最近。     

A Broadly Reactive One-Step SYBR Green I Real-Time RT-PCR Assay for Rapid Detection of Murine Norovirus

A one-step SYBR Green I real-time RT-PCR assay was developed for the detection and quantification of a broad range of murine noroviruses (MNVs). The primer design was based on the multiple sequence alignments of 101 sequences of the open reading frame (ORF)1−ORF2 junction of MNV. The broad reactivity and quantitative capacity of the assay were validated using 7 MNV plasmids. The assay was completed within 1 h, and the reliable detection limit was 10 copies of MNV plasmid or 0.063 median tissue culture infective doses per milliliter of RAW264 cell culture-propagated viruses. The diagnostic performance of the assay was evaluated using 158 mouse fecal samples, 91 of which were confirmed to be positive. The melting curve analysis demonstrated the diversity of MNV in the samples. This is the first report of a broadly reactive one-step SYBR Green I real-time RT-PCR assay for detecting of MNVs. The rapid and sensitive performance of this assay makes it a powerful tool for diagnostic applications.     

Structural assessment of SARS-CoV2 accessory protein ORF7a predicts LFA-1 and Mac-1 binding potential

ORF7a is an accessory protein common to SARS-CoV1 and the recently discovered SARS-CoV2, which is causing the COVID-19 pandemic. The ORF7a protein has a structural homology with ICAM-1 which binds to the T lymphocyte integrin receptor LFA-1. As COVID-19 has a strong immune component as part of the disease, we sought to determine whether SARS-CoV2 would have a similar structural interaction with LFA-1. Using molecular docking simulations, we found that SARS-CoV2 ORF7a has the key structural determinants required to bind LFA-1 but also the related leukocyte integrin Mac-1, which is also known to be expressed by macrophages. Our study shows that SARS-CoV2 ORF7a protein has a conserved Ig immunoglobulin-like fold containing an integrin binding site that provides a mechanistic hypothesis for SARS-CoV2’s interaction with the human immune system. This suggests that experimental investigation of ORF7a-mediated effects on immune cells such as T lymphocytes and macrophages (leukocytes) could help understand the disease further and develop effective treatments.