人前列腺特异膜抗原膜外区基因的克隆表达及抗体的制备

利用RT PCR技术 ,从前列腺癌组织总RNA中扩增人前列腺特异膜抗原 (PSMA)基因编码区序列 ,克隆至pcDNA3.1载体 ,以此为模板再次PCR扩增出PSMA膜外区cDNA(edPSMA) ,序列测定表明克隆获得的PSMA及edPSMA与基因库所登录的序列相一致。构建原核表达质粒pMAL c2x edPSMA ,经IPTG诱导表达的MBP edPSMA融合蛋白分子量约 12 0kD ,Westernblot证实表达产物可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合。用直链淀粉琼脂糖凝胶 (Amyloseresin)亲和层析纯化蛋白质可得到电泳均一的融合蛋白 ,免疫BALB C小鼠制备多抗 ,获得效价为 1∶12 80 0的多克隆抗体 ,该抗体可用于前列腺癌组织标本PSMA表达的检测     

人血管生成素cDNA的克隆与表达

血管生成素 ( angiogenin,ANG)广泛存在于多种肿瘤组织中 ,在肿瘤发生的不同阶段刺激新生血管的形成 .利用 RT- PCR方法从培养的人肺癌细胞系 A549扩增得到了 ANG c DNA片段 ,测序正确后克隆入融合表达载体 p RSETB中 ,构建了原核表达菌株 .经 IPTG诱导 ,表达了 N端融合His6的 ANG融合蛋白 ,表达量占菌体总蛋白的 1 0 % ,纯化后的血管生成素体外能够有效地刺激鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成 .     

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

 从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .     

鹿茸富脯氨酸多肽-APRP基因融合表达载体的构建及表达

目的:构建鹿茸富脯氨酸多肽(APRP)基因融合表达载体,并诱导表达融合蛋白GST-APRP。方法:以鹿茸顶端组织总c DNA为模板,PCR方法扩增目的片段,连接p MDTM18-T载体,转化E.coli DH5α进行TA克隆。酶切与测序鉴定合格后,将目的片段与p GEX-6P-1质粒连接,完成p GEX-6P-1-APRP融合表达载体的构建。利用原核表达系统进行初步诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白表达情况。结果:PCR成功扩增出目的基因片段,目的基因片段大小为216 bp。提取表达载体质粒经酶切及测序分析证实p GEX-6P-1-APRR融合表达载体构建成功。利用终浓度为0.5 m MIPTG诱导,融合蛋白成功表达,分子量为35 k Da。结论:目前利用基因工程技术获得特定的鹿茸多肽的报道很少。本研究结果表明,利用原核表达系统可在体外对鹿茸富脯氨酸多肽基因(APRP)进行融合表达,并且融合蛋白GST-APRP以可溶形式表达,有利于进一步研究APRP。这也为研究其他鹿茸多肽单体成分提供重要参考。     

结核分枝杆菌Rv1884c基因的克隆及其原核表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv1884c基因的表达蛋白。方法:制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX-4T-1构建质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH5α,再经IPTG诱导表达GST-1884融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式。结果:扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,转化大肠杆菌DH5α后经诱导产生了高水平的表达产物。结论:构建了pGEX-4T-1-Rv1884c质粒载体,并诱导表达了GST-1884融合蛋白,为进一步研究Rv1884c蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

家蚕核型多角体病毒BmNPV囊膜蛋白P74膜外区克隆和原核表达

通过PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)囊膜蛋白p74基因膜外区片段,对切胶纯化得到的DNA目的片段与原核表达载体pET28a进行连接,通过不同浓度的IPTG对含有pET28a-p74重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE电泳.结果表明p74基因膜外区获得了表达;通过His单抗对原核表达产物进行Western blotting分析,其结果证实诱导蛋白带为融合有组氧酸的目的蛋白.对割胶获得的P74蛋白和免疫佐剂进行克分研磨,以研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,通过收获的抗血清对BmNPV ODV病毒粒子进行Westem blotting分析,检测到一条分子量大小为74 kD的特异杂交带,表明获得的多抗可用于P74蛋白功能的进一步研究.     

黄曲霉细胞壁蛋白AFLMP1的基因克隆与原核表达

根据NCBI数据库中的黄曲霉细胞壁蛋白AFLMP1的基因序列设计特异引物,以黄曲霉菌总RNA逆转录获得的c DNA为模板,PCR扩增目的基因后分别克隆到p GEX-6p-1和p ET-22b原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。重组大肠杆菌经IPTG诱导表达后超声波破碎提取可溶性蛋白,SDS-PAGE电泳和Western杂交检测表达产物,结果表明GST-AFLMP1和AFLMP1-His融合蛋白能够在大肠杆菌中大量可溶性表达,可分别作为制备AFLMP1特异抗体的免疫抗原和筛选抗原。     

水稻线粒体延伸因子OsEF-Tu基因的克隆及表达

[目的]克隆水稻线粒体基因Os EF-Tu并进行表达。[方法]RT-PCR分别扩增Os EF-Tu基因c DNA的5’端和3’端序列,重叠PCR克隆Os EF-Tu的c DNA序列。生物信息学分析Os EF-Tu基因,构建水稻线粒体基因Os EF-Tu原核表达载体并转化BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白。[结果]Os EF-Tu蛋白与多个高等植物线粒体延长因子EF-Tu蛋白具有同源性,p GEX-4T1-Os EF-Tu重组子构建成功并表达出带有GST标签的Os EF-Tu融合蛋白。[结论]水稻Os EF-Tu在高等植物中较为保守,原核表达Os EF-Tu融合蛋白在28℃诱导条件下包涵体中表达量高。     

绵羊精子赤道膜蛋白片段1(SPESP1)的克隆、原核表达及纯化

旨在克隆绵羊Spesp1 c DNA并表达,得到纯化的GST-SPESP1融合蛋白。以绵羊睾丸组织总c DNA为模板,根据Gen Bank公布的绵羊基因组序列设计引物,PCR扩增得到Spesp1 c DNA,构建原核表达重组载体p GEX-Spesp1,将其转化到E.coliBL21中表达,并优化其表达条件,利用SDS-PAGE切胶纯化法得到纯化的融合蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果表明,经测序,克隆得到的Spesp1 c DNA序列与Gen Bank中预测的c DNA序列对比有两个碱基不同,并造成一个氨基酸的差异。在E.coliBL21中成功表达重组融合蛋白,其最优表达条件为:37℃、4 h、0.005%IPTG终浓度,SDS-PAGE和Western blotting中,融合蛋白位于约64 k D处并可以被抗GST和抗羊SPESP1的抗体识别,与预计相符,表明融合蛋白成功表达。成功纯化得到GST-SPESP1融合蛋白,为研究SPESP1在精卵细胞膜融合中的功能奠定了基础。     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .     

重组FAS分子的表达、纯化及抗体制备

用ＰＣＲ法扩增出编码人ＦＡＳ分子胞外区的ｃＤＮＡ片段,直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,经ＤＮＡ序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－ＫＧ的ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ位点之间,构成重组质粒ｐＫＧ－ｈＦＡＳ,将此质粒导入大肠杆菌,经ＩＰＴＧ诱导后获得ＧＳＴ－ｈＦＡＳ重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ经亲合层析获得纯化的ＧＳＴ－ｈＦＡＳ蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除ＧＳＴ部分,得到纯化的ＦＡＳ蛋白．用纯化的ＦＡＳ抗原免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体,经检测发现抗ＦＡＳ抗体能诱导Ｕ９３７细胞发生细胞凋亡     

抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达

目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。     

斜纹夜蛾GST基因的原核表达载体构建、融合蛋白表达及Northern印迹分析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是生物体内重要的解毒酶系之一。根据斜纹夜蛾(Spodoptera litura)GST基因设计特异引物,从cDNA文库中扩增GST基因并克隆至pGEM-T载体,经鉴定后经SpeⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与表达载体pPROEX HTb连接,转化感受态细胞E.coliDH5α,经PCR鉴定和双酶切鉴定得到阳性重组质粒pPROEX HTb-GST,在IPTG诱导下,获得融合蛋白的表达。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为25KD的GST融合蛋白。Northern杂交结果表明,2龄期斜纹夜蛾GST基因在mRNA水平上的表达量最大,3龄期次之,5龄期时的表达量最小。     

Expression of human soluble tissue factor in yeast and enzymatic properties of its complex with factor VIIa.

The extracellular domain of human tissue factor (TF, amino acids 1-217) was expressed in Saccharomyces cerevisiae, using the inducible yeast acid phosphatase promoter and the yeast invertase signal sequence to direct its secretion into the culture broth. Two active soluble forms sTF alpha (high molecular weight form) and sTF beta (low molecular weight form) were purified, the yield being approximately 10 and 1 mg/liter of culture supernatant, respectively. sTF alpha had an apparent molecular mass of 150 kDa on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and contained more than 200 residues of mannose/mol of protein. sTF beta had an apparent molecular mass of 37 kDa and contained 22 residues of mannose/mol of protein. N-Glycosidase F treatments of both rTFs reduced the apparent molecular mass to 35 kDa. The amino-terminal sequences and amino acid compositions of sTF alpha and sTF beta were consistent with those deduced from the cDNA sequence, thereby indicating that the difference in molecular mass is caused by heterogeneity of oligosaccharide structures. Of these recombinant TFs, sTF beta enhanced factor VIIa-amidolytic activity 40-fold toward the chromogenic substrate and 147-fold toward the fluorogenic substrate, affecting mainly the kcat value. The enhancement was comparable with that of TF purified from human placenta. The TF-mediated enhancement of factor VIIa-amidolytic activity was inhibited by heparin-activated antithrombin III, forming a high molecular weight complex. As treatment of sTF beta with denaturants such as guanidine hydrochloride or urea led to a biphasic loss of the activity, the extracellular domain of TF probably consists of two discrete domains. This expression system provides a significant amount of the extracellular domain of TF so that studies of interactions with factor VII are feasible.     

Neurturin基因克隆及在大肠杆菌中表达

Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ（ Ｎ Ｔ Ｎ）是最近发现的一种与胶质细胞源性神经营养因子（ Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ）相关的神经营养因子．利用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法以染色体 Ｄ Ｎ Ａ 为模板,扩增获得了编码人 Ｎ Ｔ Ｎ 成熟蛋白的基因,将其克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９ 质粒,进行序列分析,结果与文献报道一致．将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体ｐ Ｔｈｉｏ Ｈｉｓ 系统,在宿主菌 Ｔｏｐ１０ 中获得了高效、稳定表达,表达的ｈ Ｎ Ｔ Ｎ 占菌体总蛋白 ２０％ 左右．这为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础．     

人小肠三叶因子在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术将人小肠三叶因子(hITF)基因重组入表达载体pGEX-4T-1,构建了融合蛋白GST-hITF的重组表达质粒pGTF,在大肠杆菌中诱导表达。表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切和凝胶过滤层析得到纯化的hITF蛋白。测定了重组蛋白的氨基酸组成、分子量及其对酸和蛋白酶的抗性。Western印迹表明重组蛋白具有hITF的抗原性,并对大鼠胃溃疡具有明显的预防和保护作用。     

P40蛋白在大肠杆菌内的表达及初步纯化

P40蛋白是我们新发现的 p40基因编码的一种含有 357个氨基酸残基的蛋白质 (另文发表 ) .有关专家们预言 ,随着人类基因组计划的完成 ,基因后时代即蛋白时代即将来临 .拥有新基因并不是我们的最终目的 ,只是在我们的科研工作中开拓了一个新领域 .对新基因功能的研究必需获得其编码的蛋白质 .p40基因是我们从正常人脑内克隆的一个脑内高表达的新基因 .脑是人体内功能最为奥秘的器官 ,对脑内新基因的发现和功能研究是揭示脑功能的必经之路 .获得 P40蛋白是我们研究 p40基因的第一步 .该蛋白可用于免疫动物以获得多克隆抗体 ,为今后的研究工作 …     

G蛋白Rab3a cDNA的克隆与表达

利用PCR法 ,从人胎盘总cDNA中扩增得到Rab3acDNA的全编码区 .序列分析表明 ,扩增得到的Rab3acDNA有 5个核苷酸发生了变异 ,但翻译的氨基酸与发表的完全一致 .将扩增得到的Rab3acDNA克隆于原核融合表达载体pGEX 4T 1中 ,在E .coliBL2 1中经IPTG诱导表达 .为了进一步鉴定表达产物 ,对纯化后的Rab3a蛋白进行了SDS PAGE、N端氨基酸测序、质谱分子量测定及氨基酸组成分析鉴定 .结果显示 ,表达蛋白的分子量约 2 5kD ,N端氨基酸序列为MASATDSR ,氨基酸组成分析表明 ,Rab3a蛋白获得了正确表达