~(125)Ⅰ标记乙型肝炎病毒DNA探针的制备及应用

本文报道用国产~125I-碘化钠标记乙型肝炎病毒DNA制备探针,可得到较高比度的产物,一般稳定在10~7—10(?)cpm/μg DNA。用该探针对不标记的乙型肝炎病毒DNA进行点分子杂交。可检测到5pg左右DNA。对17例血液标本进行点分子杂交,结果与32p-标记乙型肝炎病毒DNA探针杂交结果基本一致。     

油菜叶绿体4.5S rRNA与高梁ctDNA杂交及作为探针的应用

提取纯化了油菜叶绿体核糖体4.5S RNA(4.5S rRNA)并在其5’端标记 ³²P,作为探针与高梁叶绿体DNA(ctDNA)进行分子杂交。结果证明油菜4.5Sr RNA可作为公用探针,对一般植物,特别是高等植物进行分子杂交研究。杂交的结果得到两条带。     

35S标记重组植物钙调素的制备方法

利用³⁵S标记的氨基酸混合物喂养工程菌,成功地制备了³⁵S标记的拟南芥钙调素亚型2（³⁵S-ACaM2）,对其纯度、放射活度、电泳行为及其灵敏性等进行了检测.结果表明从工程菌中制备的³⁵S-ACaM2纯度高、放射活度高、Ca²⁺与EGTA存在时的电泳行为与未标记的ACaM2相同,可作为一种高灵敏性的探针用于检测钙调素结合蛋白.     

三标记参入法及其在硒对淋巴细胞代谢影响研究中的应用

分别以 ³H-UR, ¹⁴C-Leu, ¹²⁵I-UdR为前体,采用三标记参入方法,更严格地在同一样品中同时观察了淋巴细胞染硒前后DNA,RNA,蛋白质的合成及变化。结果表明该方法可行,且显著提高了实验效率;三种受试硒化合物在10^-8—10^-4mol/L浓度范围内对DNA,RNA,蛋白质合成均具有双相性影响,在中毒浓度时,三种硒化合物的毒性顺序为:亚硒酸钠＞硒酸钠＞硒蛋氨酸。     

35S-α-dATP用于缺口转移标记探针DNA及蓖麻蚕核型多角体病毒(ArNPV)多角体蛋白基因的初步定位

本文用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多角体蛋白基因mRNA的cDNA为探针,用 ³⁵S-α-dATP为标记化合物,经缺口转移体外标记探针DNA,用旋转柱层析法分离出标记探针,由膜上DNA-DNA杂交,将ArNPV的多角体蛋白基因定位,确定是在其EcoRⅠ-Ⅱ片段上。     

大鼠前脂细胞质膜Na+/H+交换同时参与细胞的增殖和分化

以原代培养的大鼠前脂细胞为模型 ,以 2′ ,7′ bis ( 2 carboxyethyl) 5 ( 6 ) carboxyfluorescein (BCECF)作为检测胞内pH(pHi)的荧光探针 ,测定不同生长因子刺激下胞内pH的变化 ,证明大鼠肾周前脂细胞质膜存在Na⁺/H⁺交换活性 ,胎牛血清(FCS)能快速激活Na⁺/H⁺交换 ,导致pHi升高 (约 0 .2pH单位 ) ,并引起DNA合成 .Ethyl isopropyl amiloride (EIPA)抑制Na⁺/H⁺交换与DNA合成 .在无血清条件下 ,胰岛素不刺激DNA合成但引起细胞分化 ,表现为胞内脂滴积累和 3 磷酸 甘油脱氢酶(G₃ PDH酶 )活性增强 ,同时激活Na⁺/H⁺交换活性导致pHi升高 ;EIPA既抑制胰岛素对Na⁺/H⁺交换的激活 ,也抑制G₃ PDH酶活性增强 .结果证明 :Na⁺/H⁺交换的激活不仅与大鼠前脂细胞增殖相关 ,同时也是细胞分化的早期事件 .     

两种末端标记的寡聚核苷酸探针的比较研究

本文利用[α-³²P]-dATP 和 [γ-³²P]-ATP分别对寡聚核苷酸的3’-末端及5’-末端进行标记,研究这两种标记方法的技术途径,并结合斑点杂交,比较这两种末端标记的探针的灵敏度及特异性。结果表明:[α-³²P]-dATP虽可在寡聚核苷酸的3’-OH末端标上多个[³²P]-dAMP分子,但所得标记探针的杂交灵敏度及杂交体的稳定性均不及[γ-³²P]-ATP标记5’-末端制备的寡聚核苷酸探针。因此,当实验需要极高灵敏度的寡聚核苷酸探针时,以选择[γ-³²P]-ATP标记其5’-末端为宜。     

35S标记DNA探针检测真核单拷贝基因

本室采用国产[α-³⁵S]dATP制备DNA探针,用于检测真核单拷贝基因并初步获得了满意结果。本文还叙述了 ³⁵S取代 ³²P中标记DNA探针和Southern吸印杂交时,适宜的反应条件,优点及其意义。     

伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-/gG^-/LacZ⁺突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-/gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb/c小鼠极为安全且能保护Balb/c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

两种制备感染细胞DNA的内切酶图谱法用于单纯疱疹病毒分型的研究

用³²P标记单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型感染Vero细胞,抽提病毒DNA,然后以核酸内切酶BamHI酶切,电泳结果2个型别的病毒DNA的电泳图谱均不相同。用非同位素标记的疱疹病毒感染细胞DNA酶切,电泳与³²P-标记的病毒DNA图谱相比较,显示相同的结果。实验表明简单受染细胞DNA进行核酸酶切及电泳可用来进行疱疹病毒的分型。实验说明选择核酸内切酶进行酶切有重要的影响。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

根际优势菌耐药菌株的获得及其15N标记

对两株具有反硝化活性的根际优势细菌进行了耐药性和^１５Ｎ标记;研究了该双标记菌株在土壤中的动态及其活性。结果表明,所用双标记方法是可行的,应用标记菌株可以追踪其在土壤中的消长。结果还表明,标记^1５Ｎ菌株的^１５Ｎ丰度与供试培养基中氮源的^１５Ｎ丰度相近;标记菌株的反硝化活性与出发菌株的相同。     

几种糖液计测量糖蜜含糖量的可信性及适用范围

对糖蜜中含糖的几种比重测定方法之间的关系进行了实验比较。比较了用国产糖液计和不同测糖方法的差异。糖蜜含糖为10—30%时,Balling计与国产糖液计读数基本一致;⁰Bg值与化学定糖结果在30⁰Bg以下呈线性关系。     

大肠杆菌tRNALeu的基因克隆、高效表达和纯化

用化学法合成的tRNA^Leu 和tRNA^Leu ₂的基因分别连接到 pTrc99B质粒载体上 ,转化到大肠杆菌MT10 2中 .DNA测序筛选得到与已知tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 的基因顺序完全相同的克隆 .对带有tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 基因的 2个转化子 (MT -Leu1和MT- Leu2 )表达条件进行了优化 ,MT- Leu1和MT- Leu2总tRNA中的亮氨酸接受活力分别达到 810 pmol/A2 6 0 和 5 60 pmol/A2 6 0 :tRNA^Leu₁ 占MT -Leu1总tRNA的5 0 % ;tRNA^Leu₂ 占MT- Leu2总tRNA的 3 0 % .经DEAE Sepharose、BD -纤维素层析柱 ,可分别将MT- Leu1和MT -Leu2的总tRNA纯化到 160 0pmol/A2 6 0 .首次准确地测得了 2种等受体tRNALeu的氨酰化反应动力学常数 .     

Na+/H+逆向转运蛋白和植物耐盐性

Na⁺H⁺逆向转运蛋白对植物耐盐起着重要作用 ,它利用质膜H⁺ATPase或液泡膜H⁺ATPase及Ppiase泵H+产生的驱动力把Na⁺排出细胞或在液泡中区隔化以消除Na⁺的毒害。主要讨论植物中Na⁺H⁺逆向转运蛋白研究在分子水平的最新进展.     

河豚毒素和Cd2+对Zn2+诱发爆发波放电的影响

本文用微电极细胞内电位记录、通道阻断剂和放射性同位素等技术发现,锌离子可诱发爆发波放电(BD),钠通道阻断剂——河豚毒素对BD无效应,而钙通道阻断剂——Ca²⁺则可使BD消失,Cd²⁺可使[⁶⁵Zn²⁺]_i量减少。以上结果说明,Zn²⁺诱发BD的产生机理很可能是Zn²⁺代替Ca²⁺通过钙通道进入胞内引起的。     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

应用PAMAM dendrimers作为DNA运送载体的体外研究

Starburst^TM PAMAM dendrimers分子是一类新型的高分枝、辐射状对称的树状高分子,在生理条件下其表面具有高密度的正电荷,可以通过静电相互作用与核酸形成复合物后,介导遗传物质进入细胞.研究了G3, G3.5, G5, G7, G7.5, G9各代dendrimers分子与DNA结合后介导其转染细胞的能力,并初步评价这种复合物转染对细胞活力的影响.实验证实,全代的PAMAM dendrmers皆可与DNA结合,并可在体外培养的细胞中介导高效的DNA转染.PAMAM dendrimer/DNA复合物很稳定,在较大的pH值变化范围内(pH 2～10)不解离.PAMAM dendrimers可保护与之复合的DNA分子免受限制性内切酶的降解.在一定的电荷比范围内,高代数的dendrimers分子与DNA形成的复合物对培养细胞的转染效率高于低代数dendrimer分子,复合物所介导的转染效率在不同的细胞系之间也有差异.在有效作用浓度范围内（≤1.3×10^-1 g/L）,PAMAM dendrimers/DNA复合物对被转染细胞无毒性.但是,未与DNA复合的dendrimers分子在较低浓度时则表现出毒性,表明Starburst^TM PAMAM dendrimers分子可作为新型的低毒非病毒DNA载体,用于介导DNA对体外培养细胞的转染. 这些前期观察,为将纳米级高分子聚合物dendrimers分子作为基因转运载体应用于体内提供了初步的实验依据.     

亚硒酸钠对巨噬细胞内游离Ca2+和Mg2+的影响

用单细胞阳离子测定系统研究了SeO^2-₃对巨噬细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的影响.实验结果表明:SeO^2-₃高于10^-4mol/L时,有显著的细胞毒性.SeO^2-₃对细胞的毒性作用使细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的浓度升高但Ca²⁺浓度的升高速率比Mg²⁺快.还有,高于10^-4mol/L的SeO^2-₃对红细胞膜上的Ca²⁺-ATP酶活性有明显抑制作用.     

负压渗透处理对花粉管加载荧光染料的影响

该研究采用负压渗透技术,以正常培养2 h的丰水梨花粉为实验材料,探索负压渗透条件下,花粉管中加载Ca²⁺荧光探针(Fluo 4/AM)的方法。结果显示：(1)将花粉及花粉管进行负压处理2 h,花粉萌发率及花粉管的活性没有受到影响。(2)对培养2 h后的花粉管进行不同条件下的负压渗透处理,辅助荧光探针Fluo 4/AM进入花粉管;激光共聚焦显微镜观察发现,在低温(4 ℃)条件下,负压(-80 kPa)渗透加载荧光探针30 min,花粉管尖端可以观察到明显的Ca²⁺梯度。(3)抑制花粉管外Ca²⁺内流或降低花粉管外Ca²⁺浓度,花粉管中荧光密度也显著降低。研究认为,负压渗透辅助加载的方法可以有效促进荧光探针进入花粉管细胞内与Ca²⁺结合。