人参皂苷Rg3通过调节自噬减轻脓毒症心肌损伤

摘要 目的：探讨人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3,Rg3）对脓毒症介导的心肌损伤的作用效果及机制。方法：本研究通过对小鼠进行盲肠结扎穿孔手术的方法构建脓毒症模型。32只BALB/c小鼠随机分为假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）、人参皂苷Rg3治疗组（Rg3+CLP组）以及自噬抑制剂干预组（3-MA+Rg3+CLP组）,每组8只。术后18 h分别留取各组小鼠血浆及心肌组织。通过ELISA方法检测白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达水平。通过HE染色观察心肌组织形态结构的变化。应用Western-blot方法检测自噬及NLRP3炎性小体相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达。结果：与Sham组相比,CLP组小鼠心肌组织结构紊乱,炎性细胞浸润明显。另外,Caspase-3活性增加,NLRP3炎性小体相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）表达升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。与CLP组相比,外源应用Rg3组小鼠心肌组织炎性细胞浸润减少,并且Caspase-3活性降低,NLRP3炎性小体相关蛋白表达下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,而部分自噬相关蛋白表达升高。应用自噬抑制剂后,较单纯应用Rg3组,心肌组织损伤明显,而NLRP3炎性小体活性增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：脓毒症时NLRP3炎性小体激活,释放大量的细胞因子,进而导致心肌损伤。而Rg3治疗后,可以调节心肌细胞自噬,抑制NLRP3炎性小体激活,进而减轻细胞因子对心肌细胞的损伤。本研究表明Rg3可能通过调节心肌自噬,抑制NLRP3炎性小体的激活,进而减轻脓毒症时心脏的损伤。     

电针对快速衰老小鼠肝脏自噬及脂质代谢的影响

目的: 研究电针对快衰老小鼠(SAMP8)肝脏中自噬相关因子LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62表达的影响,探讨电针改善衰老小鼠肝脏脂质代谢的机制。方法: 30周龄雄性SAMP8小鼠随机分为模型组、药物组、电针组,每组7只,以同周龄抗快速老化SAMR1小鼠7只作为对照组。对照组和模型组动物常规饲养4周,不进行任何干预;药物组采用雷帕霉素按(10 mg·kg^-1·d^-1)腹腔注射干预(1次/日,连续每周6 d);电针组予双侧“肾俞”“太冲”穴电针治疗(15 min/次,1次/日,连续每周6 d)。检测小鼠的血清脂质代谢情况、肝脏脂质沉积情况、肝脏自噬体的分布、肝脏LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62蛋白表达与mRNA表达的变化。结果: 与对照组比较,模型组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)显著升高(P＜0.01);模型组肝脏脂滴沉积明显,自噬体减少,自噬相关因子LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7蛋白及mRNA表达水平明显下降(P＜0.01),P62蛋白及mRNA表达水平明显增高(P＜0.01)。与模型组相比,电针组与药物组小鼠血清TG、TC、LDL含量明显降低(P＜0.01);肝脏脂滴沉积减轻,自噬体增多,LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7的蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P＜0.01),P62蛋白及mRNA表达水平显著下降(P＜0.01)。电针组肝脏Beclin1、Atg7蛋白及mRNA表达水平均与药物组无明显差异(P＞0.05)。结论: 电针能够减轻肝脏脂质代谢紊乱,可能与调节肝脏自噬相关因子LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62的表达变化,从而促进SAMP8小鼠肝脏自噬有关。     

G1对EA.hy926内皮细胞内质网应激的抑制作用

目的观察GPR30受体激动剂G1对高糖诱导的EA.hy926内皮细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的影响。方法选用EA.hy926内皮细胞为研究对象,分为3组:正常对照组(Con,17.51mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,33.3mmol/L葡萄糖)、高糖+G1组(HG+G1,HG+1umol/L G1),利用流式细胞术检测3组细胞凋亡率,Western blot法检测ERS相关分子Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax、Bcl-2的表达变化,RT-PCR法检测Bip和CHOP的mRNA表达变化。结果 HG组与Con组比较,细胞凋亡率明显升高(P0.01),Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表达上调(P0.01,P0.05或P0.001),Bcl-2的表达下调(P0.01),Bip mRNA、CHOP mRNA表达上调(P0.001及P0.01);HG+G1组与HG组比较,细胞凋亡率明显降低(P0.05),Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表达下调(P0.05或P0.01),Bcl-2的表达上调(P0.05),Bip mRNA、CHOP mRNA表达下调(P0.001及P0.01)。结论 GPR30受体激动剂G1可抑制EA.hy926内皮细胞内质网应激。     

HOXA-AS2靶向miR-17对人脐静脉内皮细胞生物学功能以及炎症因子的影响

目的探讨HOXA-AS2对动脉粥样硬化（AS）模型细胞生物学功能以及炎症因子的影响及分子机制。 方法本实验共分为4个实验;实验1：用100 μg/mL的ox-LDL处理EA.hy926细胞作为ox-LDL组,正常培养的细胞作为对照组;实验2：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组;实验3：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2、si-NC、si-HOXA-AS2分别转染至EA.hy926细胞中,记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-HOXA-AS2组、si-NC组、si-HOXA-AS2组;实验4：将pcDNA3.1-HOXA-AS2与miR-NC、miR-17分别共转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组。实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测HOXA-AS2和miR-17的表达水平;蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A （P21）、cleaved caspase 3蛋白表达;MTT检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测白细胞介素-1 （IL-1）、白细胞介素-6 （IL-6）水平;荧光素酶报告实验检测HOXA-AS2和miR-17的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与对照组比较,ox-LDL组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.23±0.02比1.02±0.10）,细胞增殖率[（47.83±5.01）﹪比（100.06±10.20）﹪]均降低,细胞凋亡率[（26.81±2.47）﹪比（8.23±0.80）﹪]、P21 （0.82±0.08比0.20±0.02）、cleaved caspase 3 （0.67±0.06比0.14±0.01）、IL-1[（792.34±59.37）ng/L比（326.14±34.59） ng/ L]和IL-6表达水平[（53.67±4.65）ng/L比（19.25±2.11）ng/L]均升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与ox-LDL+pcDNA3.1组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.87±0.09比0.22±0.02）、细胞增殖率[（89.94±8.34）﹪比（48.21±4.86）﹪]均升高,细胞凋亡率[（12.33±1.18）﹪比（26.83±2.48）﹪]、P21 （0.33±0.03比0.81±0.08）、cleaved caspase 3 （0.24±0.02比0.69±0.06）、IL-1[ （446.25±46.84）ng/L比（802.21±60.18）ng/L]和IL-6表达水平[（25.64±2.65）ng/L比（55.21±5.10）ng/L]均降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组EA.hy926细胞中miR-17表达水平（2.14±0.21比1.05±0.10）、细胞凋亡率[（23.31±2.33）﹪比（13.75±1.44）﹪]、IL-1水平[（684.26±62.38）ng/L比（451.21±43.58）ng/L]、IL-6水平[（41.29±4.37）ng/L比（26.11±2.39）ng/L]均升高,细胞增殖率[（53.67±5.46）﹪比（90.21±9.16）﹪]降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。HOXA-AS2与miR-17存在结合位点,荧光素酶报告实验显示,与miR-NC组比较,miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性降低（0.33±0.03比1.01±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）;与anti-miR-NC组比较,anti-miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性升高（2.29±0.21比1.00±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论过表达HOXA-AS2促进细胞增殖,抑制ox-LDL引起的细胞凋亡和炎症因子的释放,其机制可能与miR-17有关。     

慢病毒介导的稳定表达人GM-CSF、IL-4的EA.hy926细胞株的建立

目的:获得能够稳定表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的内皮细胞株。方法:构建重组慢病毒表达载体,在293FT细胞中进行病毒的包装,用获得的高滴度慢病毒感染EA.hy926细胞株,建立能够稳定、高效表达hGM-CSF、hIL-4的EA.hy926细胞株。结果:EA.hy926感染效率达90%以上,长期传代后阳性率仍维持在90%以上;实时定量PCR和ELISA方法证实感染后细胞hGM-CSF、hIL-4在mRNA水平的表达分别是未感染细胞的25倍和9946倍,在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的145倍和23倍。结论:构建的细胞系可以稳定表达细胞因子GM-CSF、IL-4。     

miR-124及其启动子区DNA甲基化在同型半胱氨酸致动脉粥样硬化中的作用

本文旨在探讨mi R-124在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)致动脉粥样硬化中的作用及其启动子区DNA甲基化调控机制。Apo E-/-小鼠给予高蛋氨酸饮食16周复制高同型半胱氨酸血症动物模型,并设正常对照组(C57BL/6J小鼠正常饮食)及Apo E-/-对照组(Apo E-/-小鼠正常饮食)。HE及油红O染色后观察各组小鼠主动脉粥样硬化程度;生化分析仪检测各组小鼠血清Hcy及血脂水平;复制泡沫细胞模型,油红O染色确定模型是否复制成功;分别以0、50、100、200、500μmol/L Hcy及50μmol/L Hcy+10μmol/L 5-氮杂胞苷(AZC)干预细胞。实时定量PCR(RT-q PCR)检测各组小鼠主动脉及泡沫细胞中mi R-124的表达变化;巢式降落式甲基化特异性PCR(n MS-PCR)检测各组小鼠主动脉及泡沫细胞中mi R-124启动子区DNA甲基化水平,同时在细胞水平观察DNA甲基化抑制剂AZC对mi R-124启动子区DNA甲基化水平及其表达的影响;泡沫细胞油红O染色观察mi R-124甲基化改变对细胞脂质蓄积的影响。结果显示,与Apo E-/-对照组相比,高蛋氨酸组小鼠血清Hcy水平显著升高(P0.01),且主动脉发生明显粥样变,mi R-124的表达水平显著降低(P0.01),而mi R-124启动子区DNA甲基化水平显著升高(P0.01)。给予不同浓度Hcy刺激泡沫细胞后,mi R-124的表达水平呈下降趋势,而mi R-124启动子区DNA甲基化水平逐渐升高,且随Hcy浓度增加改变越明显,呈剂量依赖关系(P0.05,P0.01),给予AZC干预后可逆转上述变化(P0.05)。以上结果提示,mi R-124表达下调可能在Hcy致动脉粥样硬化过程中发挥重要作用,而mi R-124启动子区高甲基化改变可能是其表达下调的重要机制。     

绞股蓝皂苷调控长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡对ApoE~(-/-)AS小鼠肝脏脂质沉积的影响及机制研究

为探讨绞股蓝皂苷通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE~(-/-)AS小鼠肝脏脂质沉积防治AS机制,本实验将10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组,20只健康ApoE~(-/-)小鼠随机分为模型组、绞股蓝皂苷组(高脂饲料喂养12周),灌胃给药4周。HE染色观察小鼠肝脏脂质沉积情况,全自动生化分析仪检测血脂水平,实时荧光定量Q-PCR检测长链非编码TUG1、miRNA-26a表达,实时荧光定量Q-PCR及Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP基因及蛋白表达。结果显示模型组ApoE~(-/-)小鼠血脂水平发生紊乱,肝细胞体积变大,脂肪空泡明显,小鼠肝脏Lnc-TUG1表达显著升高,miRNA-26a显著下降(P0.01);Bax、Cyt-c、cleaved caspase-3、cleaved PARP mRNA及蛋白表达显著升高,Bcl2 mRNA及蛋白显著下降(P0.01或P0.05);cleaved caspase-9蛋白表达显著升高(P0.01或P0.05),cleaved caspase-9 mRNA仅有上升趋势;绞股蓝皂苷干预后血脂紊乱得以改善,肝细胞脂肪变性程度减轻,脂肪空泡明显减少,小鼠肝脏Lnc TUG1表达有所下降,miRNA-26a表达有所上调(P0.05),小鼠肝脏Bax、Cyt-c、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 mRNA及蛋白表达显著下调,Bcl2 mRNA及蛋白显著上调(P0.01或P0.05),cleaved PARP蛋白表达显著下调(P0.05),cleaved PARP mRNA仅有下调趋势;研究结果提示绞股蓝皂苷可能通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE~(-/-)AS小鼠肝脏脂质沉积,进而防治动脉粥样硬化。     

人参皂苷Rb1对Aβ_(1-42)导致的Tau蛋白异常磷酸化的影响

为探讨人参皂苷Rb1对Aβ_(1-42)所致小鼠脑片微管相关蛋白(Tau)异常磷酸化的抑制作用及其可能机制,采用Aβ_(1-42)诱导小鼠海马脑片建立Tau蛋白过度磷酸化模型,运用免疫印迹方法观察人参皂苷Rb1对Aβ1-42导致小鼠脑片p-Tau、p-Erk1/2、Erk1/2蛋白水平的影响。实验结果显示,模型组p-Tau、p-Erk1/2表达水平明显高于空白对照组(P0.01);与模型组比较,人参皂苷Rb1各剂量组p-Tau、p-Erk1/2表达水平显著性降低(P0.01或P0.05),且大、中剂量组优于小剂量组;人参皂苷Rb1呈一定的剂量依赖性下调Aβ_(1-42)导致的p-Tau、p-Erk1/2的蛋白水平。本研究表明,人参皂苷Rb1可能通过抑制Erk1/2的激活逆转Aβ_(1-42)所导致的Tau蛋白水平的升高来减少神经纤维缠结。     

苦荞麦总黄酮对PA诱导脐静脉内皮细胞DDAH_2表达的影响

观察苦荞麦总黄酮对软脂酸(PA)诱导的人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)中二甲基精氨酸二甲胺水解酶Ⅱ(DDAH2)表达等指标的影响,探讨苦荞麦总黄酮在胰岛素抵抗信号传导通路中的作用机制。将EA.hy926细胞株常规培养、传代,部分用600μmol/L PA造模后分为对照组、模型组、苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组,苦荞麦总黄酮组进一步加入浓度为125 mg/L的苦荞麦总黄酮,二甲双胍组加入浓度为2 mmol/L的二甲双胍。双抗体夹心法测定ADMA含量;硝酸还原酶法测定NO含量;RT-PCR法测定DDAH2mRNA表达;Western-blot测定DDAH2蛋白表达。苦荞麦中、高剂量组与模型组比较,ADMA含量明显减少,NO含量明显增加,均有显著性差异(P0.05);苦荞麦总黄酮组与模型组比较,DDAH2mRNA和蛋白表达量增加,有显著性差异(P0.05)。苦荞麦总黄酮对于PA诱导下EA.hy926细胞中DDAH2、NO的合成具有明显促进作用,对ADMA的合成有明显抑制作用。     

罗布麻总黄酮通过PI3K/Akt/GSK3β抑制H_2O_2诱导的EA.hy926凋亡机制研究

心血管疾病严重危害人类健康,其致病机制主要是氧化应激诱导的内皮细胞凋亡,保护内皮细胞免受氧化应激损伤是防治心血管疾病的关键。为了探讨罗布麻总黄酮(total flavonoids of Folium Apocyni Veneti,TFF)抑制过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导的EA.hy926细胞凋亡的机制,采用不同浓度TFF处理EA.hy926细胞,一定浓度的H_2O_2造模,通过MTT法、Hoechst33342/PI荧光双染、流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况,并用Western-blot和荧光定量PCR检测相关蛋白及m RNA的表达水平。研究发现,H_2O_2能明显诱导EA.hy926细胞凋亡,而TFF可降低H_2O_2引起的内皮细胞凋亡,表现为凋亡率降低、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)增加、裂解的半胱天冬酶-3,-9(cleaved caspase-3,-9)表达减少、髓细胞白血病因子-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)表达增加、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase-3β,PI3K/Akt/GSK3β)通路中Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平升高。上述结果表明,TFF主要是通过激活PI3K/Akt/GSK3β通路,调节Mcl-1的表达,保护MMP,进而抑制caspase蛋白的剪切活化,抑制H_2O_2诱导的EA.hy926凋亡。     

TGF-β1信号在成纤维细胞促血管生成中作用的研究

该研究旨在探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号在成纤维细胞促血管生成中的作用。实验通过ELISA检测了Hepa1-6细胞上清液中TGF-β1的含量。将胎鼠成纤维细胞分三组,分别用普通培养液(DMEM/F12组)、含Hepa1-6细胞上清液的条件培养液(Hepa1-6组)以及加入1μmol/L TGF-β1受体抑制剂(GW788388)的条件培养液(GWHepa1-6组)培养。采用免疫荧光双染法、q PCR检测培养的成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的蛋白质及m RNA表达水平。采用基质胶(Matrigel)血管形成实验检测成纤维细胞上清液作用下EA.hy 926细胞的血管形成能力。ELISA结果显示,与DMEM/F12相比,Hepa1-6细胞上清液中TGF-β1表达量明显升高(P0.01)。免疫荧光双染法和q PCR结果显示,与DMEM/F12组和GWHepa1-6组比较,Hepa1-6组成纤维细胞中α-SMA和VEGFA蛋白质及m RNA相对水平明显增加(P0.01),且在第5 d时达最高,其上清液诱导EA.hy 926细胞的血管形成能力明显增强(P0.01)。该研究表明,TGF-β1信号通路可以诱导成纤维细胞α-SMA和VEGFA的表达,进而促进EA.hy 926细胞形成小管样结构。     

人参皂苷Rb1调节脑微血管NOS/NO改善脑细胞膜通透性

目的:探究人参皂苷Rb1在脂多糖(LPS)诱导的人脑微血管细胞模型中对脑细胞膜通透性的影响。方法:采用噻唑蓝比色法(MTT)及乳酸脱氢酶(LDH)释放检测不同浓度人参皂苷Rb1对LPS刺激人脑微血管内皮细胞系(HBMEC)存活率的影响;采用EVOM法检测HBMEC细胞通透性;采用Griess法、ELISA法及DAF-FM DA荧光探针分别检测NO、ONOO~-含量及eNOS、iNOS活性;Western blot法检测p-eNOS(ser1177)、iNOS蛋白的表达水平。结果:与正常对照组比较,LPS(5μg/m L)可明显降低HBMEC细胞存活率(P0.01);与LPS组比较,随着人参皂苷Rb1浓度的增加细胞存活率明显升高,且中、高剂量组(40、80μmol/L)具有显著性差异(P0.05、P0.01);LPS导致HBMEC单层细胞电阻值明显降低(P0.01),人参皂苷Rb1高剂量组(80μmol/L)可显著抑制LPS所致的细胞膜通透性升高(P0.05);LPS可明显降低HBMEC细胞NO含量(P0.01)升高ONOO~-含量(P0.05),人参皂苷Rb1中、高剂量组(40、80μmol/L)较LPS组具有显著升高NO含量,降低ONOO~-含量的作用(P0.05);与正常对照组比较,LPS组可明显降低HBMEC细胞磷酸化eNOS (ser1177)蛋白的表达水平,而显著升高iNOS蛋白表达水平(P0.01)。人参皂苷Rb1高剂量组(80μmol/L)较LPS组可显著升高p-eNOS(ser1177)蛋白的表达水平,降低iNOS蛋白的表达水平(P0.05)。结论:人参皂苷Rb1可有效降低iNOS活性,升高eNOS活性继而减少NO水平及ONOO~-含量,显著降低LPS导致的脑细胞膜通透性升高。     

Trx通过Sirt3-P53通路促进自噬并改善高糖诱发的CMECs损伤

目的:明确硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)通过自噬调节对大鼠心脏微血管内皮细胞损伤的保护作用及相关机制。方法:分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞并分为:(1)正常对照组;(2)高糖组;(3)高糖+Trx组;(4)高糖+Trx+Ad-sh Sirt3组;(5)高糖+Trx+Ad-sh P53组;(6)高糖+DMSO空载组。通过In Vitro Vascular Permeability Assay Kit检测单层心脏微血管内皮细胞通透性,TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot法检测Sirt3、P53、Atg5、LC3BI/II等相关自噬相关信号通路关键蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比,高糖引起单层心脏微血管内皮细胞通透功能损伤,增加细胞凋亡,抑制自噬,且Sirt3、Atg5、LC3BI/II表达下降而P53表达上升;给予Trx可以上调Sirt3、Atg5、LC3BI/II蛋白表达水平,抑制P53表达,并显著减轻上述高糖引起的细胞损伤;但是,分别干扰Sirt3和P53表达后,Trx的作用明显减弱。结论:Trx通过Sirt3-P53信号通路促进心脏微血管内皮细胞自噬,降低细胞凋亡,改善高糖诱发的大鼠心脏微血管内皮细胞损伤。     

左旋卡尼汀对脂多糖诱导小鼠肺微血管内皮细胞自噬和凋亡的影响*

目的:探讨左旋卡尼汀(LC)对脂多糖(LPS)损伤的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)的保护作用及自噬、凋亡的影响。方法:采用体外培养的小鼠PMVECs,分为对照组(Control组)、LPS组(10 μg/ ml,3、6、12、24 h)、LPS(10 μg/ ml,24 h)+LC(终浓度为2.5、5、10 μg/ml)(LC组)。Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡,细胞免疫荧光染色法检测自噬小体,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3及凋亡蛋白Caspase-3的含量,CCK-8法检测细胞活力。结果:① 与Control组比较,LPS 6 h、12 h、24 h组PMVECs细胞活力显著受到抑制,细胞凋亡率、自噬蛋白LC3Ⅱ表达显著增高(P均＜0.01),LC3蛋白阳性表达。②与LPS 24 h组比较,各浓度LC组PMVECs细胞活力显著提高、自噬蛋白LC3II表达水平显著升高(P均＜0.01),而PMVECs凋亡率和凋亡蛋白Caspase-3表达水平均明显降低 (P＜0.05)。结论:LC具有提高LPS刺激的小鼠PMVECs活性、促进PMVECs自噬、抑制凋亡的作用。     

不同形态的烟曲霉对巨噬细胞自噬水平的影响

目的探究烟曲霉静息孢子、膨胀孢子以及菌丝对巨噬细胞自噬水平的影响。方法培养烟曲霉并收获静息孢子,在沙保弱液体培养基中振荡不同时间获得膨胀孢子及菌丝。以3种形态的烟曲霉分组处理RAW264.7细胞,免疫印迹法检测LC3BⅡ蛋白的表达量,逆转录PCR检测自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12 mRNA的转录水平。观察不同形态的烟曲霉刺激GFP-LC3B-RAW264.7细胞后GFP-LC3B的表达与定位。结果膨胀的烟曲霉孢子及菌丝刺激巨噬细胞后LC3BⅡ表达水平升高;Atg5与Atg12 mRNA的转录均明显增高,Atg7转录水平无显著变化;膨胀孢子诱导LC3B呈斑点样聚集并与之共定位,烟曲霉菌丝刺激后自噬体增多。结论烟曲霉膨胀孢子与菌丝能显著提高巨噬细胞自噬水平,静息的分生孢子不能引起巨噬细胞自噬功能的应答。     

鳞翅目昆虫中自噬相关分子Atg8的研究进展

自噬是细胞通过溶酶体自主降解以实现细胞内物质循环利用的过程,在昆虫细胞分化和个体发育中起着重要作用。鳞翅目昆虫属于完全变态昆虫,会通过自噬和凋亡完成蜕变重建过程,是研究自噬机制的模式生物。自噬相关蛋白Atg8是哺乳动物微管相关蛋白1轻链3的同系物,是自噬相关蛋白的核心蛋白家族,对自噬小体形成、膜的延伸、特定物质识别等具有重要意义。文中就鳞翅目昆虫Atg8在自噬信号通路中的作用、Atg8结构特点、Atg8表达分布及Atg8-PE/Atg8水平与自噬活性关系进行了综述。Atg8-PE是自噬信号通路中两个类泛素结合系统之一,在自噬中起着关键作用。序列分析表明,鳞翅目昆虫Atg8与其他真核生物同源蛋白的整体结构相似,尤其与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列高度一致,体现了Atg8的高度保守性。鳞翅目昆虫发育不同阶段,Atg8在中肠、唾液腺、卵巢、脂肪体、丝腺等器官中的表达分布各不相同。并且,Atg8在核质中分布也存在差异,Atg8在细胞核与细胞质之间的穿梭可能存在蛹化前阶段的某些细胞中。通过检测Atg8-PE在细胞内的表达水平或Atg8含量的变化,可以评价细胞自噬的发生程度。     

人参皂苷Rg3联合苏拉明通过下调TGF-β1表达抑制小鼠肺癌生长转移

目的:肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,中晚期肺癌以放化疗为主,毒副作用大,观察低毒副作用的人参皂苷Rg3和苏拉明联合对小鼠Lewis肺癌生长转移的抑制作用及机制,为临床安全高效治疗肺癌提供实验资料.方法:将40只接种好Lewis肺癌细胞的C57BL6小鼠随机分为5组,每组8只:A组:对照组、B组:顺铂组、C组:人参皂苷Rg3组、D组:苏拉明组、E组:人参皂苷Rg3联合苏拉明组.接种第4天后开始药物干预,第20天处死,取肺组织,计肺转移结节数,剥离.移植瘤,计瘤重,计算抑瘤率,通过RT-PCR及Western-blot检测移植瘤TGF-β1的mRNA及蛋白的表达.结果:各药物干预组的肺转移结节数及瘤重明显低于对照组(P＜0.05,P＜0.01),人参皂苷Rg3联合苏拉明组最明显;BCDE各组抑瘤率分别为:(19.69±5.61)％、(35.37±8.97)％、(35.85±7.55)％和(49.39±6.99)％,ABCDE各组的肺转移率分别为100％、100％、100％、87.5％和62.5％;各药物干预组的TGF-β1的mRNA及蛋白的表达均低于对照组(P＜0.01),且人参皂苷Rg3联合苏拉明组TGF-β1的表达明显低于人参皂苷Rg3组和苏拉明组(P＜0.05).结论:人参皂苷Rg3联合苏拉明具有抑制小鼠Lewis肺癌的生长转移作用,对晚期肺癌的抑制可能与下调TGF-β1的表达有关.     

Notch1对糖尿病肾小管间质细胞外基质沉积的影响

本文旨在明确糖尿病肾小管间质中Notch1和自噬水平的变化对细胞外基质沉积的影响,并探讨其机制。取db/m小鼠(正常对照组)和db/db小鼠(糖尿病组)各8只,饲养12周后测定相应的生化指标;同时,体外在正常糖(normal glucose, NG)和高糖(high glucose, HG)条件下培养大鼠肾小管导管上皮细胞(NRK52E细胞),用Western blotting检测各组细胞中Notch1和LC3蛋白表达变化;在NG和HG条件下过表达和敲低Notch1,用共聚焦显微镜观察自噬流变化,用细胞免疫荧光化学法观察肾小管上皮细胞中Notch1、I型和III型胶原蛋白(Collagen-I和III)变化。结果显示,与db/m小鼠比较,db/db小鼠肾组织中Notch1和Collagen-III表达增加(P <0.01),而LC3表达降低(P <0.05);体外实验结果显示,HG组与NG组比较,NRK52E细胞Notch1蛋白表达增加(P <0.01),LC3表达明显降低(P <0.01),高渗组与NG组比较,以上蛋白表达无明显变化;高糖条件下敲低Notch1...     

自噬在TXNIP过表达诱导的INS-1胰岛细胞凋亡中的作用

硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是内源性硫氧还蛋白结合抑制蛋白,在糖尿病患者血清和组织中均高表达。本研究观察TXNIP过表达对正常糖脂浓度下培养的INS-1细胞自噬水平的影响,并分析自噬在TXNIP诱导的细胞凋亡中的作用。常规培养的INS-1胰岛细胞分为正常培养组、空病毒(Ad-eGFP)组和TXNIP过表达(Ad-TXNIP-eGFP)组,后两组转染相应腺病毒,48 h后测定TXNIP mRNA和蛋白的表达情况;用Western blot检测各组自噬相关的Beclin-1、LC3和P62的蛋白表达情况,以cleaved caspase 3/caspase 3比值和流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;用IF/ICC法检测各组细胞内自噬体数量的变化。结果显示,与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组TXNIP mRNA和蛋白表达量均明显升高;与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白表达水平升高,P62蛋白表达降低,自噬体荧光强度增强,细胞凋亡率升高,cleaved caspase 3/caspase 3比值上升。使用自噬抑制剂3-MA干预后,与TXNIP过表达组相比,TXNIP过表达+3-MA组自噬明显受到抑制,同时凋亡明显减轻。以上结果提示,在正常糖脂浓度培养下的INS-1细胞过表达TXNIP可以通过诱导自噬促进细胞凋亡。     

过表达Atg5通过上调细胞自噬水平抑制瓣膜间质细胞成骨样分化

该文的主要目的是探究过表达自噬相关蛋白Atg5对主动脉瓣膜间质细胞自噬水平以及成骨样分化能力的影响,为钙化性主动脉瓣膜疾病的研究提供新方法和新思路。从猪主动脉瓣上分离原代瓣膜间质细胞,细胞免疫荧光进行表型鉴定后,采用成骨培养基诱导瓣膜间质细胞成骨分化,并用Western blot检测细胞成骨指标Runx2、OPN与自噬指标p62和LC3B-II/I的蛋白表达水平;构建重组质粒pAdTrack-ATG5并通过脂质体转染瓣膜间质细胞,采用Q-PCR、Western blot以及免疫荧光染色检测转染后细胞Atg5的表达水平和细胞自噬水平的变化情况;对成骨诱导培养的主动脉瓣膜间质细胞分别转染空载质粒和过表达Atg5质粒,利用Western blot检测72 h后瓣膜间质细胞早期成骨指标Runx2、OPN的表达,并用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色方法检测瓣膜间质细胞晚期成骨样分化能力。结果显示,原代分离培养的瓣膜间质细胞的间质细胞标志物α-SMA和vimentin的染色结果呈阳性,内皮细胞标志物vWF的染色结果呈阴性;与对照组比较,用成骨培养基培养的瓣膜间质细胞Runx2、OPN和p62的蛋白表达水平显著上调,LC3B-II/I的比值显著下调;测序结果显示,过表达质粒pAdTrack-ATG5构建成功;在转染pAdTrack-ATG5后,细胞Atg5的基因表达水平和蛋白表达水平均显著上调,自噬指标p62蛋白表达水平显著下调,LC3B-II/I比值显著上调,免疫荧光染色显示,LC3B聚集增加;与转染空载质粒组相比,转染pAdTrack-ATG5组细胞在成骨培养基培养72 h后成骨指标Runx2、OPN的蛋白表达水平显著下降,转染pAdTrack-ATG5组碱性磷酸酶染色和茜素红S染色结果的阳性程度均弱于转染空载质粒组。综上所述,过表达Atg5能上调细胞自噬水平,并抑制瓣膜间质细胞成骨样分化。