白花蛇舌草多糖提取物对喉癌Hep-2细胞内质网自噬的影响*

目的:探讨白花蛇舌草多糖提取物(HDPE)对喉癌Hep-2细胞内质网自噬的影响。方法:实验分为对照组、HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA(自噬抑制剂)组,噻唑盐比色法(MTT)检测各组细胞培养24 h、48 h、72 h后增殖抑制率;原位末端转移酶标记法(TUNEL)法检测各组培养48 h细胞凋亡情况;单丹黄酰尸胺(MDC)染色观察各组培养48 h细胞自噬体及自噬溶酶体的变化;透射电镜观察培养48 h细胞内质网周围自噬囊泡的产生情况;蛋白印迹法(Western blot)检测各组培养48 h细胞Beclin-1蛋白(Beclin-1)、微管相关轻链蛋白3Ⅰ(LC3Ⅰ)、微管相关轻链蛋白3Ⅱ(LC3Ⅱ)、葡萄糖调节蛋白 78(GRP78)、活化转录因子6(ATF6)及CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达。结果:与对照组比较,HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA组细胞增殖抑制率、凋亡指数AI升高,MDC阳性细胞率量降低,内质网周围自噬囊泡减少,GRP78、ATF6及CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高,Beclin-1表达降低(P＜0.05);与3-MA组比较,HDPE 400 mg/L组细胞增殖抑制率、凋亡指数AI升高,MDC阳性细胞率、GRP78、ATF6及CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高,Beclin-1表达降低(P＜0.05)。结论:HDPE可能通过抑制喉癌Hep-2细胞内质网自噬,促进细胞内质网应激凋亡,进而抑制Hep-2细胞增殖能力。     

大负荷运动诱导大鼠骨骼肌损伤对其自噬超微结构及Beclin1和LC3-II/I的影响*

目的: 观察大负荷离心运动对大鼠骨骼肌自噬超微结构及自噬相关蛋白Beclin1和LC3II/I的影响。方法: 48只SD雄性大鼠适应性训练后随机分成对照组(C,n=8)和大负荷离心运动组(E,n=40)。E组于跑台进行90 min下坡跑,运动后0 h、12 h、24 h、48 h和72 h取比目鱼肌,透射电镜观察其自噬体超微结构变化;Western blot检测Beclin1和LC3II/I蛋白表达;免疫荧光观测LC3的定位及含量变化。结果: E组比目鱼肌自噬体数量在运动后0 h、12 h和24 h均有增加,并伴LC3自噬荧光明显增强(P＜0.01),同时运动后48 h自噬荧光仍有显著性升高(P＜0.05);Beclin1和LC3II/I在大负荷离心干预后表达升高(P＜0.05),运动后12 h～24 h达到峰值(P＜0.01),直至运动后72 h完全恢复。结论: 大负荷离心运动可诱导骨骼肌自噬超微结构变化,自噬蛋白表达增强,以上可能是运动损伤的骨骼肌功能下降的原因之一。     

维生素C联合替莫唑胺对胶质瘤细胞的毒性作用及其机制*

目的:探讨维生素C(VC)联合替莫唑胺(TMZ)对胶质瘤细胞活力的毒性作用及其机制。方法:在体外条件下培养人胶质瘤细胞BMG-1和SHG44细胞,设对照组(不施加VC与TMZ)、TMZ组(0.2 mmol/L)、VC(0.5 mmol/L)+TMZ(0.2 mmol/L)组,TMZ(0.2 mmol/L TMZ)+U0126(10 μmol/L)组,每组实验重复3次。采用MTT实验检测细胞生存率;流式细胞术和Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡情况; ROS检测试剂盒检测活性氧簇(ROS)水平, Western blot检测与凋亡、自噬及ERK通路相关蛋白的表达。结果:与对照组比较,TMZ组胶质瘤细胞的存活率显著下降(P＜0.05)。与TMZ组比较,VC+TMZ组胶质细胞瘤细胞的存活率显著下降(P＜0.01),VC+TMZ组中细胞凋亡率显著升高,且Bax、Cleaved caspase-3及Cleaved PARP蛋白表达显著增加,Bcl-2表达显著降低,而ROS水平及细胞自噬率显著降低,LC3-II/LC3-1表达显著降低,p62表达显著增加(P均＜0.05)。同时,联用可降低BMG-1和SHG44细胞中的p-ERK1/2相关蛋白的表达水平,且提高细胞凋亡率(P均＜0.05)。结论:VC联合TMZ能够增强对胶质瘤细胞的毒性,而这一作用是通过ERK信号通路来促进细胞凋亡并抑制替莫唑胺所介导的自噬作用。     

不同浓度桦木酸对人胃癌MGC-803细胞自噬的影响

目的: 本研究利用不同浓度桦木酸处理人胃癌MGC-803细胞,以探究其对细胞自噬的影响。方法: 将人胃癌MGC-803细胞分为4组,每组3个复孔,对照组不加桦木酸处理,其余三组分别加入终浓度为10、20、30 mg/L桦木酸。桦木酸处理细胞48 h后,qRT-PCR检测桦木酸对人胃癌MGC-803细胞自噬相关基因mRNA表达的影响。Western blot检测药物处理细胞自噬相关基因的蛋白表达。利用免疫荧光检测药物处理后MGC-803细胞内LC3蛋白的胞内定位及表达。结果: 与对照组相比,在10～30 mg/L浓度范围内,桦木酸处理的人胃癌MGC-803细胞LC3、Beclin-1 mRNA的表达明显升高(P＜0.05),Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达显著升高(P＜0.05),LC3-Ⅰ蛋白的表达明显降低(P＜0.05),其中30 mg/L处理组表现最佳。此外,桦木酸还可诱导MGC-803细胞LC3蛋白在细胞质内形成点状聚集。结论: 在10～30 mg/L浓度范围内,桦木酸能诱导人胃癌MGC-803细胞发生自噬。     

Apelin-13对LPS诱导人脐静脉内皮细胞屏障损伤的干预作用*

目的: 探讨Apelin-13对LPS诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)屏障损伤的影响。方法: 将体外培养的HUVECs分为4组:正常对照组、LPS组、Apelin-13+LPS组、Apelin-13组。用5 μg/ml LPS作用细胞24 h, 复制屏障功能受损模型。1 μmol/L Apelin-13提前30 min给予,再给予LPS作用24 h,确定Apelin-13的影响。通过CCK8法检测Apelin-13对细胞活力的影响;Western blot检测血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)、纤维状肌动蛋白(F-actin)表达变化;免疫荧光检测VE-cadherin、F-actin的表达变化及核转录因子Kappa B(NF-κB p65)入核情况。结果: 与正常对照组相比,单独给予Apelin-13对细胞活力无明显影响。与正常对照组相比,LPS组细胞活力明显下降(P＜0.01),VE-cadherin蛋白表达下降(P＜0.01)、F-actin蛋白表达升高(P＜0.05),NF-κB p65入核明显增加。与LPS组相比,Apelin-13明显增加细胞活力(P＜0.01),VE-cadherin蛋白表达增加(P＜0.05)、F-actin蛋白表达下降(P＜0.01),蛋白NF-κB p65入核下降明显。结论: Apelin-13可减轻LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤及屏障受损,其机制可能与抑制炎症相关。     

丙泊酚对转化生长因子-β1诱导肝星状细胞激活的影响及其机制

目的: 观察丙泊酚对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肝星状细胞系HSC2-T6细胞激活的影响并探讨其可能的作用机制。方法: 实验分为对照组、TGF-β1组、丙泊酚组、TGF-β1+丙泊酚组、雷帕霉素组、TGF-β1+丙泊酚+雷帕霉素组。先用含雷帕霉素(5 μmol/L)DMEM培养液培养1 h,用丙泊酚(100 μmol/L)处理1 h,然后再加入TGF-β1(5 ng/ml)继续共同培养24 h。细胞的增殖水平通过MTT法测量,细胞培养液上清中透明质酸(HA)、IV型胶原(IV-C)和层粘连蛋白(LN)的浓度采用ELISA法测量,细胞的超微结构采用透射电镜观测,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)及自噬相关基因Beclin 1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和p62的表达通过Western blot测量。结果: 与对照组比较,TGF-β1组细胞增殖、α-SMA蛋白的表达、培养液上清中HA、IV-C和LN的浓度、自噬体数量、Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著性增加(P均＜0.05),p-mTOR蛋白的表达和p-mTOR/mTOR比值及p62的蛋白表达显著性降低(P均＜0.05)。与TGF-β1组比较,丙泊酚+TGF-β1组细胞增殖、α-SMA蛋白的表达、培养液上清中HA、IV-C和LN的浓度、自噬体数量、Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均显著性降低(P均＜0.05),p-mTOR蛋白表达和p-mTOR/TOR比值及p62的蛋白表达均显著性增加(P均＜0.05)。mTOR抑制剂雷帕霉素部分逆转丙泊酚的作用。结论: 丙泊酚抑制TGFβ1诱导的肝星状细胞激活,其机制涉及mTOR-自噬途径。     

新型多胺代谢酶抑制剂SI-4650对结肠癌CT-26细胞增殖的影响及其机制*

目的: 探讨本实验室新发现的新型多胺代谢酶小分子抑制剂SI-4650对结肠癌CT-26细胞增殖、自噬和凋亡的影响。方法: 体外培养CT-26细胞,以0 μmol·L^-1 SI-4650处理48 h细胞为正常对照组,单独2.5 mmol·L^-1 3-MA处理细胞为自噬抑制对照组,40、80 μmol·L^-1SI-4650处理48 h细胞以及3-MA联合40、80 μmol·L^-1SI-4650处理48 h细胞为4个实验组,化学发光法检测CT-26细胞中多胺代谢酶SMO和APAO酶活性的变化,HPLC法检测细胞中多胺含量的变化,CCK8法检测CT-26细胞增殖能力变化;PI单染结合流式细胞术分析细胞周期;Western blot法分析细胞自噬;PI/FITC-Annexin V双染、JC-1荧光探针和Fluo-3 AM钙离子荧光探针分别结合流式细胞术以及Western blot法分析细胞凋亡。结果: 与正常对照组比较,40、80 μmol·L^-1 SI-4650实验组细胞生长抑制率分别为36.98%、46.91%,有效抑制肿瘤细胞增殖(P＜0.01);同时细胞中SMO和APAO酶活性下降(P＜ 0.01);细胞中多胺总含量减少(P＜0.01);CT-26细胞被阻滞在G0/G1期(P＜0.01);凋亡细胞数分别为7.69%和 16.87%,细胞中钙浓度增加(P＜0.01)、线粒体膜电位下降(P＜0.01),c-PARP、Bax表达增加(P＜0.01)、Bcl-2含量减少(P＜0.01);以及CT-26细胞中自噬相关蛋离子白Beclin-1、LC3-Ⅱ以及P62含量显著上升(P＜0.01)。与单独40、80 μmol·L^-1SI-4650处理组相比,2.5 mmol·L^-1 3-MA联合40、80 μmol·L^-1SI-4650实验组细胞自噬水平下降(P＜0.01),凋亡相关蛋白、线粒体膜电位和钙离子浓度变化均减弱(P＜0.01),凋亡细胞数减少(P＜0.01)。结论: SI-4650有效抑制结肠癌CT-26细胞增殖,机制可能与抑制多胺代谢酶活性,干扰多胺代谢,减少多胺总含量以及诱导细胞周期阻滞、细胞自噬和凋亡相关。     

电针对快速衰老小鼠肝脏自噬及脂质代谢的影响

目的: 研究电针对快衰老小鼠(SAMP8)肝脏中自噬相关因子LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62表达的影响,探讨电针改善衰老小鼠肝脏脂质代谢的机制。方法: 30周龄雄性SAMP8小鼠随机分为模型组、药物组、电针组,每组7只,以同周龄抗快速老化SAMR1小鼠7只作为对照组。对照组和模型组动物常规饲养4周,不进行任何干预;药物组采用雷帕霉素按(10 mg·kg^-1·d^-1)腹腔注射干预(1次/日,连续每周6 d);电针组予双侧“肾俞”“太冲”穴电针治疗(15 min/次,1次/日,连续每周6 d)。检测小鼠的血清脂质代谢情况、肝脏脂质沉积情况、肝脏自噬体的分布、肝脏LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62蛋白表达与mRNA表达的变化。结果: 与对照组比较,模型组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)显著升高(P＜0.01);模型组肝脏脂滴沉积明显,自噬体减少,自噬相关因子LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7蛋白及mRNA表达水平明显下降(P＜0.01),P62蛋白及mRNA表达水平明显增高(P＜0.01)。与模型组相比,电针组与药物组小鼠血清TG、TC、LDL含量明显降低(P＜0.01);肝脏脂滴沉积减轻,自噬体增多,LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7的蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P＜0.01),P62蛋白及mRNA表达水平显著下降(P＜0.01)。电针组肝脏Beclin1、Atg7蛋白及mRNA表达水平均与药物组无明显差异(P＞0.05)。结论: 电针能够减轻肝脏脂质代谢紊乱,可能与调节肝脏自噬相关因子LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62的表达变化,从而促进SAMP8小鼠肝脏自噬有关。     

苦参素复合长春新碱对HCT-8/VCR细胞耐药性的影响及其机制*

目的: 探究苦参素复合长春新碱对HCT-8/VCR细胞耐药性的影响及其机制。方法: HCT-8/VCR体外培养,分为空白组、苦参素单药组,长春新碱单药组、苦参素和长春新碱联合组,每组6个复孔。CCK-8法检测各组HCT-8/VCR细胞的耐药性;MDC法检测细胞内自噬小泡的变化;ELISA法检测IL-6的含量;Western blot检测自噬相关基因与免疫因子TLR4蛋白的表达水平。结果: 苦参素复合长春新碱可降低HCT-8/VCR细胞的耐药性,逆转倍数为3.23;与空白组比较,苦参素组和联合组自噬体含量降低、IL-6含量也明显降低(P＜0.01),长春新碱组自噬体含量升高,IL-6含量也明显升高(P＜0.01);联合组与苦参素组比较,自噬体含量升高,而IL-6含量降低(P＜ 0.01);Western blot实验表明,与空白组比较,苦参素组P62的表达降低(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、TLR4均升高(P＜0.05),长春新碱组和联合组P62的表达升高(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、TLR4均降低(P＜ 0.05);联合组与长春新碱组比较,P62的表达升高(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、TLR4均降低(P＜0.05)。结论: 苦参素与长春新碱联合可显著降低HCT-8/VCR的耐药性,其机制与抑制自噬活动和TLR4信号活化有关。     

固脾消积饮诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制*

目的: 探讨固脾消积饮对人肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制。方法: 将HepG2细胞分为4组:对照组(Control)、空白血清组(Blank)、固脾消积饮血清组(GPXJY)和顺铂组(Positive),每组设置8个复孔。固脾消积饮含药血清和顺铂干预24 h后,检测细胞活性、活细胞数量、细胞凋亡状态、细胞周期以及线粒体膜电位状况,检测细胞的脂质过氧化(MDA)水平、糖酵解速率和凋亡Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达,检测细胞上清液三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、丙酮酸和葡萄糖的含量。结果: 与Control组比较,GPXJY组(细胞的)抑制率增加、细胞数量减少、凋亡阳性细胞数增多(P＜0.01),G1期细胞数目显著增加(P＜0.05),细胞线粒体膜电位降低(P＜0.01),糖酵解功能显著抑制,细胞中MDA水平升高,细胞Bax、Caspase-3的表达升高、Bcl-2的表达下降(P＜0.05,P＜0.01),细胞上清液中TC、TG、葡萄糖含量显著减少、丙酮酸含量显著增加(P＜0.05,P＜0.01)。结论: 固脾消积饮可诱导HepG2细胞发生凋亡,可能对能量代谢发挥作用。     

过表达微小RNA-130a-3P对LPS诱导心肌细胞损伤的干预作用及其机制*

目的: 探讨miRNA-130a-3p对脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞自噬与凋亡的影响及分子机制。方法: H9C2心肌细胞随机分为5组,即正常对照组,LPS模型组,miRNA阴性对照组(miRNA-negative control组),miRNA-130a-3p mimics组(过表达miRNA-130a-3p),miRNA-130a-3p mimics+LY294002组(过表达miRNA-130a-3p + PI3K抑制)。LPS模型组即终浓度为10 μg/ml的LPS诱导24 h,miRNA阴性对照组与miRNA-130a-3p mimics组是利用lipo3000将阴性对照miRNA及miRNA-130a-3p mimics转染至H9C2细胞,培养24 h后,再将LPS加入培养基中培养24 h。miRNA-130a-3p mimics + LY294002组是利用lipo3000将miRNA-130a-3p mimics转染至H9C2细胞,同时在培养基中加入10 μmol/L(终浓度)的LY294002,培养24 h后,再将浓度为10 μg/ml的LPS加入培养基中培养24 h。所有实验均重复5次以上。利用RT-qPCR检测细胞中miRNA-130a-3p mRNA的表达水平,利用CCK-8实验检测细胞活性,利用ELISA实验检测细胞培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-1β (IL-1β)的含量,利用比色法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量;利用Western blot检测细胞中p-PI3K蛋白,p-AKT蛋白,Bax蛋白,Bcl-2蛋白,cleaved-caspase-3蛋白,LC3蛋白,p62蛋白的表达水平。结果: 结果显示,与正常组相比较,LPS模型细胞中miRNA-130a-3p mRNA水平,p-PI3K蛋白与p-AKT蛋白的水平显著低于正常对照组(P<0.01);与LPS组相比较,miRNA-130a-3p mimics组细胞中p-PI3K,p-AKT蛋白的表达显著升高(P<0.01,P<0.05);与正常对照组相比较,LPS组细胞活性显著降低,细胞培养液中TNF-α,IL-6,IL-1β及 LDH的含量显著升高(P<0.01), SOD的含量显著降低(P<0.01),细胞中Bax蛋白,cleaved caspase-3蛋白,p62蛋白的表达显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达和LC3II/I的比率显著降低(P<0.01);与LPS组相比较,miRNA-130a-3p mimics可提高细胞活性,降低细胞培养液中TNF-α,IL-6,IL-1β及LDH的含量(P<0.01,P<0.05),提高SOD的含量(P<0.05),降低细胞中Bax蛋白,cleaved caspase-3蛋白,p62蛋白的表达(P<0.01),促进Bcl-2蛋白的表达(P<0.01),提高LC3II/I的比率(P<0.05);与miRNA-130a-3p mimics组相比较,miRNA-130a-3p mimics+LY294002组,可部分逆转miRNA-130a-3p mimics对细胞的作用。结论: 过表达miRNA-130a-3p可部分通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞的自噬与抑制细胞凋亡,减轻LPS诱导的心肌细胞损伤。     

不同浓度桦木酸对人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响

目的: 以人胃癌MCG-803细胞为实验材料,探讨不同浓度桦木酸(BA)对人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响,为其临床应用提供依据。方法: 将人胃癌MGC-803细胞分成 4 组,每组设置 3 个复孔,对照组为未加入桦木酸的 MGC-803 细胞,3 组实验组分别加入终浓度为10、20、30 μg/ml桦木酸处理细胞48 h后,通过激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态变化;检测桦木酸对细胞Caspase-3和Caspase-9活性的影响;利用流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化;qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9和Cytochrome C(Cyt c)mRNA及蛋白水平的表达变化。结果: 与对照组比较, 各处理组Caspase-3和Caspase-9活性显著升高(P＜0.01),线粒体膜电位显著下降(P＜0.01),Caspase-3、Caspase-9和Cyt c mRNA及蛋白表达均显著上调(P＜0.01)。结论: 在终浓度为10 ~30 μg/ml浓度范围内,桦木酸通过调节Caspase-3、Caspase-9和Cyt c的表达诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡。     

自噬抑制肿瘤坏死因子α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞发生凋亡

目的:探讨TNF-α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞(hfPMSCs)发生凋亡和自噬的作用,以及自噬对细胞凋亡的调控作用。方法:利用流式细胞术检测无血清培养hfPMSCs中CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的表达;用终浓度20μg/L的TNF-α处理hfPMSCs 24h,以未处理细胞作为对照组。Annexin V/PI双染色检测TNF-α对hfPMSCs凋亡程度的影响;分别提取各组总蛋白,Western blot检测自噬标志基因LC3Ⅰ/Ⅱ的表达;利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞,观察胞内点状聚集形成的情况;利用Atg5干扰慢病毒(si-Atg5)及阴性对照慢病毒(si-NC)感染hfPMSCs,Annexin V/PI双染色检测TNF-α对慢病毒感染后hfPMSCs凋亡程度的影响。结果:所培养细胞具有典型的MSCs形态,呈CD73~+CD90~+CD105~+/CD14~-CD34~-CD45~-细胞; Annexin V/PI染色结果显示,TNF-α作用24 h后,hfPMSCs凋亡数和凋亡率均高于对照组(P 0. 05);Western blot检测自噬标志蛋白表达结果表明,TNF-α可增加LC3Ⅱ的表达(P 0. 05);荧光共聚焦显微境观察到TNF-α可显著提高细胞中的点状聚集。利用si-Atg5感染细胞,抑制hfPMSCs自噬的发生,与对照慢病毒si-NC感染细胞比较,可显著促进TNF-α诱导hfPMSCs凋亡的发生(P 0. 05)。结论:TNF-α诱导的自噬抑制人胎盘胎儿来源MSCs凋亡的发生,具有一定的保护性作用。     

TOFA对人食管鳞癌Eca109和KYSE-450细胞生长的影响*

目的: 探讨5-十四烷氧基-2-呋喃酸(TOFA)对人食管鳞癌(ESCC)细胞Eca109和KYSE-450细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法: 将Eca-109细胞和KYSE-450细胞分为对照组(DMSO)和实验组(TOFA),细胞(4×10³ cells/100 μl)接种于96孔板中,每个浓度设置5个复孔,培养24 h后,给予DMSO(对照)和不同浓度(1、3、5、10 μg/ml)TOFA处理,继续培养24、48和72 h;MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blot检测p21、Cleaved caspase-3表达水平及p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1修饰水平,专用试剂盒检测细胞内游离脂肪酸。结果: 与DMSO组比较,TOFA以浓度和时间依赖性方式抑制Eca109和KYSE-450细胞增殖(P均<0.05),处理48 h的IC₅₀分别为4.65和3.93 μg / ml;实验组细胞G2 / M 期细胞百分比增加,细胞凋亡率增高,p21、Cleaved caspase-3蛋白表达水平上调(P均<0.05),p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1修饰水平下调(P均<0.05)。结论: TOFA抑制人食管鳞癌细胞增殖、阻滞细胞周期并促进细胞凋亡,其机制可能与其抑制AKT/mTOR/4EBP1信号通路有关。     

间歇性禁食与运动对骨骼肌自噬的激活及减脂效果的比较*

目的: 以运动作为对比,观察不同时长(14 d、28 d)间歇性禁食的体重控制效果,探究其对骨骼肌质量及自噬的影响。方法: 选取60只SD大鼠(雄)随机分为3组(n=20):安静对照组(Sed组)、间歇性禁食组(InF组)、有氧运动组(Exe组),设实验周期分别为14 d和28 d。InF组采用间歇性禁食(隔日禁食),Exe组施加跑台运动干预,每周记录体重。DEXA检测体脂并计算体脂指数,天平称量比目鱼肌湿重(双侧)并计算湿重指数,免疫荧光检测细胞外基质蛋白laminin反映肌纤维横截面积、检测LC3标记自噬体,透射电镜观察自噬体数量及形态,Western blot检测自噬相关蛋白ULK1、LC3、p62及调控蛋白AMPKα、p-AMPKα(Thr172)的表达情况。结果: ①干预7 d开始,InF、Exe组大鼠体重显著低于Sed组,且InF组体重显著低于Exe组(P＜0.01),28 d干预后InF、Exe组体脂指数显著低于Sed组,且InF组体脂指数显著低于Exe组(P＜0.05)。②干预28 d时Exe组单根肌纤维面积较Sed、InF组明显增大(P＜0.01)。③在各干预时间InF、Exe组比目鱼肌中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ULK1蛋白表达均显著高于Sed组(P＜0.05),但在14 d干预时仅InF组表现出自噬标记LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平的升高及自噬底物p62的降低(P＜0.05),Exe组中该指标在干预28 d时才出现明显差异。结论: ①间歇性禁食在控制大鼠体重、体脂增长方面优于有氧运动。②在骨骼肌自噬激活方面,间歇性禁食所需的干预时间(14 d)短于有氧运动(28 d)。     

改良内皮抑素对人脐静脉内皮细胞抑制作用的实验研究

目的:探讨改良内皮抑素(RGDRGD-ES)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用,摸索RGDRGD-ES对HUVEC细胞抑制作用的相对最佳作用浓度和时间。方法:通过快速定点诱变PCR方法获得含有RGDRGD膜序的改良人内皮抑素基因,并构建其原核表达载体。表达、纯化改良内皮抑素(RGDRGD-ES),运用MTT法和流式细胞仪检测RGDRGD-ES对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。结果:1.诱变了ES基因,获得了改良的RGDRGD-ES基因,并成功构建其原核表达载体。2.获得了RGDRGD-ES蛋白。3.改良的RGDRGD-ES能够有效抑制人脐静脉内皮细胞的生长(P<0.01);抑制率随着药物浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)的增加和作用时间(24 h、48 h、72 h)的延长而逐渐增加,具有浓度和时间依赖性(P<0.01);而30μg/ml与40μg/ml、50μg/ml组间、72 h与96 h组间无明显差异(P>0.05)。4.细胞凋亡率(作用24 h)具有药物浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)依赖性(P<0.01),30μg/ml与40μg/ml、50μg/ml组间凋亡率无明显差异(P>0.05)。结论:成功构建了改良RGDRGD-ES基因的原核表达载体,RGDRGD-ES蛋白在30μg/ml浓度作用72小时条件下能够有效抑制人脐静脉内皮细胞的生长,改良内皮抑素(RGDRGD-ES)对HUVEC的抑制作用较ES明显提高。