跨膜丝氨酸蛋白酶6与贫血

跨膜丝氨酸蛋白酶6基因（transmembrane serine protease 6 gene,TMPRSS6）是一种主要在肝脏中表达,编码II型跨膜丝氨酸蛋白酶的基因,它的突变可导致严重贫血的发生。TMPRSS6突变后可造成铁调节激素肝杀菌肽在机体缺铁状态下也表达增加,这造成小肠对食物铁的吸收减少而出现缺铁性贫血。TMPRSS6突变与贫血关系的发现一方面有利于对铁代谢调节机制的深入理解,另一方面也为铁代谢紊乱相关疾病如贫血等的治疗带来了希望。     

新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析

采用生物信息学方法分析预测新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)跨膜蛋白酶丝氨酸2(transmembrane protease serine 2, TMPRSS2)的理化特性、结构特征和抗原表位,为抗SARS-CoV-2药物研发提供参考。利用ProtParam、ProtScale分析预测TMPRSS2蛋白酶的理化特性;利用COILS Server、SignalP、TMPred、TargetP Server、NetPhos Server、NetNGlyc Server服务器对TMPRSS2蛋白酶结构进行功能结构的分析预测;利用SOPMA、Pfam、SWISS-MODEL分析预测TMPRSS2蛋白酶高级结构;利用IEBD分析预测TMPRSS2蛋白酶B细胞、T细胞表位。TMPRSS2蛋白酶氨基酸组成数为492个,其中丝氨酸占比最高;亲水性较高,含10个跨膜螺旋区;具有4个磷酸化位点,3个糖基化修饰点;二级结构中无规则卷曲占据主导地位,三级结构能与已知的5ce.1.1.A(SMTL ID)模型同源建模;存在13个潜在的B细胞表位,12个得分较高的T细胞表位。     

黄粉虫胰蛋白酶样酶基因TMTLSP全长cDNA的克隆和序列分析

以黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫全RNA逆转录得到的cDNA为模板,参照地鳖（Eupolyphaga sinensis）纤溶酶（fibrinolytic enzyme）简并引物,进行温度梯度PCR．以得到的扩增产物为基础,采用RACE得到基因全长cDNA,命名为黄粉虫胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(Tenebrio molitor trypsin-like serine protease,TMTLSP)．TMTLSP全长869 bp(GenBank No. JN662461),开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸,并具有蛋白酶样特有的起始位点、活性中心预计底物结合位点．经过比对分析,该基因编码的氨基酸序列与赤拟谷盗、谷蠹、光亮扁角水虻、美洲大蠊等多种昆虫的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶有较高的相似性．本研究将为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的提取及研究提供更为广泛的材料及研究依据．     

ClpP蛋白酶研究进展：从细菌到人线粒体

Caseinolytic protease（ClpP）是一种包含丝氨酸蛋白酶催化三联体结构域的ATP依赖的蛋白水解酶,广泛存在于原核生物以及真核生物的线粒体和叶绿体中。它通常与AAA＋家族的分子伴4gClpX结合形成ClpXV蛋白酶复合物,AAA＋家族成员能利用水解ATP提供的能量将蛋白底物去折叠,随后将底物分子转移至ClpP蛋白酶的水解腔体进行降解。ClpP蛋白酶对细胞内蛋白质量控制及维持体内稳态起到至关重要的作用。该文综述了近年来有关ClpP蛋白酶在结构、功能以及与细菌毒力的关系和有关药物开发等方面的研究。     

跨膜丝氨酸蛋白酶2在病毒感染中的作用及其抑制剂的研究进展

跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine proteinase 2,TMPRSS2)是细胞膜表面丝氨酸蛋白酶家族的一员,它具有介导冠状病毒棘突蛋白水解的作用,为冠状病毒感染宿主必需的宿主蛋白。现就近年来TMPRSS2在分子生物学功能方面的研究;TMPRSS2在呼吸系统病毒感染,尤其是在冠状病毒感染中的作用,以及以TMPRSS2为靶点的药物研究进展作一概述,旨在对冠状病毒特别是新冠病毒的预防和治疗,提供新的靶点和方向。     

丝氨酸蛋白酶与生殖

丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶,在哺乳动物的生命活动过程中扮演着重要的角色,在消化、凝血、凋亡和免疫系统中的作用早已被人们所熟知。近年来,随着对该蛋白酶家族研究的深入,发现丝氨酸蛋白酶在不明原因的不育患者和ACR–/–(acrosin)、PCSK4–/–(proprotein convertase subtilisin/kexin type 4)、PRSS21–/–(protease,serine,21)、PRSS37–/–(protease,serine,37)、PCI–/–(protein C inhibitor)、SPINKL3–/–(serine protease inhibitor Kazal-type)等敲除小鼠模型中具有很高的出现频率。因此,该文简要介绍了丝氨酸蛋白酶家族特点,并在此基础上,着重阐述了其在生殖过程中的作用。     

华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、 序列分析及表达

丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶, 为了了解该类酶的分子特性及功能, 本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库, 首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列, 命名为HoSP1（GenBank登录号为FJ573146）。序列分析表明, 该基因长902 bp, 开放阅读框（ORF）长783 bp, 编码260个氨基酸, 推测分子量和pI值分别为26.7 kDa和4.19, 不含有N-糖基化位点, 但在Thr₁₅₇处有一个O-糖基化位点, 含有6个保守的半胱氨酸残基, 组成3对二硫键, 对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现, 该酶具有组氨酸（His）、 天冬氨酸（Asp）、 丝氨酸（Ser）催化中心, 与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性, 其中与CzSP3的序列一致性最高, 为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后, 进行体外表达, 以BTEE为底物, 测得该酶的活力为0.0378 μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。     

一种凋亡相关蚯蚓丝氨酸蛋白酶的纯化、活性鉴定及部分性质研究

通过多级柱层析,从赤子爱胜蚓抽提物（一组抗肿瘤活性蛋白成分）中纯化得到凋亡相关丝氨酸蛋白酶1（apoptosis-related serine protease 1, ARSP1）,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得其表观分子质量为28 ku.ARSP1非变性PAGE图谱为相连的多条带,质谱图为多头峰,MALDI-TOF-MS测得各主峰相对分子质量为24 645,25 052和25 281,等电聚焦电泳测得等电点pI＜3.8.测得ARSP1 N端25个氨基酸序列为：I(V)IGGT(S)N(D)ASPGEFPWQLSQTRGGSHS,N端序列比较结果显示其与丝氨酸蛋白酶类高度同源.体外实验中,不仅通过凋亡细胞的相差显微观察验证了ARSP1的细胞杀伤活性,而且进一步通过荧光抗体技术对其直接杀伤细胞活性进行了定位研究.Schiff's试剂糖蛋白染色法鉴定ARSP1为糖蛋白（或糖肽）,纤维蛋白平板法测得ARSP1同时具有纤溶酶和纤溶酶原激活酶活性,进一步通过苯甲磺酰氟(PMSF)对其纤溶酶活性的抑制实验,证明属于丝氨酸蛋白酶类.     

蛇毒丝氨酸蛋白酶多样性──底物专一性免疫化学及序列比较研究

本文报道烙铁头（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓｍｕｃｒｏｓｑｕａｍａｔｕｓ）蛇毒纤维蛋白原溶酶（ＴＭＶＦｇ），眼镜王蛇（Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓｈａｎｎａｈ）蛇毒纤维蛋白原溶酶（ｏｈＳ１），竹叶青（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓｓｔｅｊｎｅｇｅｒｉ）蛇毒专一纤溶酶原激活剂（ｓｖ－ｐＡ）对５种小分子多肽底物的底物专一性，及这些蛇毒丝氨酸蛋白酶对各种凝血因子（第Ｘ因子、凝血酶原、纤溶酶原、蛋白Ｃ）的作用，并和其它蛇毒丝氨酸蛋白酶如矛头蝮（Ｂｏｔｈｒｏｐｓａｔｒｏｘ）蛇毒凝血酶样酶（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）、铜头蝮（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ）蛇毒蛋白Ｃ激活剂ＡＣＣ－Ｃ、蝰蛇（Ｖｉｐｅｒａｒｕｓｓｅｌｌｉ）毒第Ⅴ因子激活剂ＲＶＶ－Ｖ进行比较研究。通过酶标偶联免疫反应研究了抗ｓｖ－ＰＡ抗体与各种丝氨酸蛋白酶的免疫交叉反应，并对蛇毒丝氨酸蛋白酶及相应功能的哺乳动物蛋白酶进行了序列比较分析。从底物专一性多样性及已知序列结构分化上对这一类蛇毒丝氨酸蛋白酶的结构与功能进行了探讨和研究。     

跨膜丝氨酸蛋白酶研究进展

跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSSs),又名II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSPs)是一类定位于细胞膜上具有保守丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白家族,哺乳动物中已发现二十多个成员.TMPRSSs 基本结构类似,C端蛋白酶结构域在胞外,N端位于胞内,还拥有单跨膜结构域,差异之处在于主干区.TMPRSSs具有多种重要生理功能,功能异常可造成耳聋、癌症、贫血和高血压等多种疾病.本文对TMPRSSs基本特征、结构、生理功能及相关疾病进行综述.     

苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。     

昆虫天然免疫反应分子机制研究进展

昆虫体内缺乏高等脊椎动物所具有的获得性免疫系统, 只能依赖发达的天然免疫系统抵抗细菌、 真菌、 病毒等外源病原物的侵染。本文概括了昆虫天然免疫反应发生和作用的分子机制相关进展, 重点阐述了重要免疫相关因子在昆虫天然免疫反应中的功能和作用机制。昆虫天然免疫反应分为体液免疫和细胞免疫两种, 二者共同作用完成对病原物的吞噬 (phagocytosis)、 集结 (nodulation)、 包囊 (encapsulation)、 凝结 (coagulation)和黑化（melanization）等。当昆虫受到外界病原物的侵染时, 首先通过体内的模式识别蛋白（pattern recognition proteins/receptor, PRPs）识别并结合病原物表面特有的模式分子（pathogen-associated molecular pattern, PAMPs）, 继而一系列包括丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂在内的级联激活反应被激活和调控, 产生抗菌肽、 黑色素等免疫效应分子, 清除或杀灭外源物。抗菌肽是一类小分子量的阳离子肽, 具有广谱抗菌活性, 针对不同类型的病原物, 抗菌肽的产生机制也不尽相同。昆虫体内存在着两种信号转导途径调节抗菌肽的产生： 一是由真菌和大部分革兰氏阳性菌激活的Toll途径; 二是由革兰氏阴性菌激活的Imd途径（immune deficiency pathway）。这两个途径通过激活不同转录因子调控不同抗菌肽基因的表达参与昆虫体内的天然免疫反应。     

HCV丝氨酸蛋白酶小分子底物构建及GST融合表达

丝氨酸蛋白酶是丙型肝炎病毒重要的功能蛋白和药物作用靶点,其通过分子内（cis）和分子间（trans）方式催化水解前体蛋白,释放病毒功能蛋白。目的：为深入研究病毒蛋白酶活性和抑制剂鉴定需要,实验研究参照丙型肝炎病毒1a亚型菌株蛋白酶天然底物的氨基酸序列特点,设计了一段包含两个天然底物酶切位点的小分子多肽2S,并进行了原核表达。方法：利用PCR方法,合成2S小分子多肽基因,目的基因两端引入BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点,双酶切后将基因与表达载体pGEX-4T-2重组,转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导进行GST融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的GST 2S融合蛋白在体外反应系统进行酶切鉴定,SDS-PAGE和ELISA鉴定酶切结果。结果：PCR合成的小分子底物多肽2S基因,经与表达载体重组后测序,证实基因序列正确。采用0.5mmol/L浓度的IPTG诱导工程菌过夜,获得表达的目的蛋白,经分离纯化得到融合蛋白GST-2S。GST-2S在体外磷酸盐缓冲系统中与丝氨酸蛋白酶反应,15%SDS-PAGE鉴定酶切产物,证实融合蛋白底物条带明显消失,ELISA结果同样说明融合蛋白的底物活性。结论：含有两个天然底物酶切位点的小分子多肽可以替代病毒天然底物,实验结果为丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶活性研究和酶抑制剂研究奠定了方法学基础。     

蛋白激酶C-δ在细胞凋亡中的作用及其分子机制

蛋白激酶C-δ（protein kinase C-δ, PKC-δ）是细胞内重要的信号转导分子,在动物体内广泛表达,具有多种重要的细胞功能,如细胞增殖、死亡和免疫等,尤其在细胞凋亡中扮演重要的角色。在细胞凋亡过程中,PKC-δ可通过构象变化或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）剪切等过程被激活。激活的PKC-δ由细胞质向线粒体或细胞核进行转位。被caspase-3切割的PKC-δ,产生具有激酶活性的催化片段（PKC-δ-catalytic fragment, PKC-δ-CF）,作用于下游底物蛋白质,活化促凋亡相关的调控因子,促进细胞凋亡;同时PKC-δ还具有抗凋亡的调控功能。本文对PKC-δ在细胞凋亡中的作用与分子机制及在肿瘤发生与治疗中的作用进行综述,以期为进一步明确PKC-δ在细胞凋亡中的作用机制提供资料。     

呼吸道蛋白酶TMPRSS2和HAT裂解流感病毒血凝素的亚细胞定位及对蛋白酶抑制剂的不同敏感性

流感病毒表面糖蛋白血凝素（HA）被宿主细胞蛋白酶裂解是病毒感染和扩散的关键。已有研究表明,人呼吸道胰蛋白酶样蛋白酶（HAT）和跨膜丝氨酸蛋白酶S1成员2（TMPRSS2）是人类呼吸道裂解HA的蛋白酶。     

牙鲆弹性蛋白酶cDNA全长和蛋白质结构分析

为研究牙鲆丝氨酸蛋白酶家族的功能和及其家族的分子进化规律,从本实验室已构建的牙鲆肝胰脏cDNA文库进行了部分测序,从而筛选出一个弹性蛋白酶新成员：弹性蛋白酶5。在此基础上,结合Genbank数据库中已经提交的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶,对三者蛋白质进行了序列分析和三维结构的比较。牙鲆弹性蛋白酶cDNA包含一个完整的读码框（提交Genbank的登录号为EU873084）。其编码区平均GC含量为54％,推测编码的蛋白质包含296个氨基酸,分子量为29．04KD,等电点为6．14。蛋白序列比较表明它和牙鲆弹性蛋白酶3相似性最高。通过同源建模得到弹性蛋白酶5的三维结构和牛胰凝乳蛋白酶结构相似,包含了2个α螺旋、β个8折叠和13个转角结构。牙鲆弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶中底物结合区的3个关键氨基酸有明显的区别,这些氨基酸的变化改变了底物结合位点开口的大小,胰凝乳蛋白酶2的三个关键氨基酸和牛胰凝乳蛋白酶相同,该区域能接受结构较大的芳香族氨基酸;胰蛋白酶3能更好的结合阳性氨基酸Lys或Arg;而弹性蛋白酶开口很小,只能结合小的残基。上述结果证明了牙鲆丝氨酸蛋白酶家族中的弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶底物结合位点的结构差异决定了其对底物选择的特异性。     

定量蛋白质组学揭示酵母去泛素化酶Ubp14生物学功能

泛素化是一种动态可逆的蛋白质翻译后修饰,泛素分子在泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶的级联酶促反应催化下共价连接到底物蛋白上。去泛素化酶将泛素分子从底物上移除,动态可逆地调控泛素化修饰,在成熟泛素的生成、泛素链的移除与修剪、游离泛素链的回收等过程中发挥着关键的调控作用。本文的研究对象是酵母中泛素特异性蛋白酶（ubiquitin specific protease,USP）家族成员Ubp14,负责回收细胞内游离的泛素链。本研究定量比较了酵母细胞中Ubp14缺失对全蛋白质组的影响,进而找出其潜在的调控通路和分子功能。首先,通过同源重组技术构建了ubp14Δ菌株,发现其生长速度低于野生型酵母。利用稳定同位素氨基酸代谢标记技术结合深度覆盖的蛋白质组学分析技术,系统比较了ubp14Δ菌株相对于野生型菌株的差异蛋白,共计鉴定3 685个蛋白,通过统计学分析筛选得到109个差异蛋白。基因本体论分析发现,Ubp14缺失引起的差异蛋白主要参与了包括氨基酸代谢、氧化还原和热应激等生物学过程。本研究为深入探究去泛素化酶Ubp14的生物学功能,进而深刻理解游离泛素的稳态平衡与生物学过程调控提供了高可信的蛋白质组学数据信息。     

Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类普遍存在的蛋白酶抑制剂,在体内各项生命活动中扮演着重要角色。这类抑制剂结构稳定且富有特色,通常具有一个或几个串联存在的Kunitz结构域,能够以类似底物的方式与丝氨酸蛋白酶结合,从而抑制酶的活性。在功能方面,Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂参与凝血和纤维蛋白溶解、肿瘤免疫、炎症调节以及抵抗细菌、真菌感染等过程。文中就Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展作一综述,为新型Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的开发提供研究思路。     

跨膜丝氨酸蛋白酶6：一种新发现的铁调素调节子

跨膜丝氨酸蛋白酶6(TMPRSS6)是最近发现的一种丝氨酸蛋白激酶,它通过调节铁调素(hepcidin)的表达,进而影响生物机体的铁稳态.它的发现,不仅对进一步认识机体铁代谢的调控及其分子机制有重要的理论意义,还为揭示铁代谢相关疾病的病因和探索治疗的相关途径提供了新的思路.     

甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶

甘露聚糖结合凝集素（MBL）是一种重要的天然免疫防御分子,通过激活MBL相关丝氨酸蛋白酶（MAST）而启动补体激活凝集素途径来清除病原体。本文就MASP的基因、分子结构及功能等方面研究概况作一介绍。