结核分枝杆菌潜伏感染诊断方法的新进展

每年有超过8百万人感染结核,其中绝大部分没有发展为活动性结核病,而是表现为潜伏性结核感染。大多数活动性结核病是潜伏感染的结核杆菌重新被激活所致,因此结核潜伏感染者成为结核患者的重要来源。及早诊断和治疗结核潜伏感染者是控制结核传播的最有效手段之一。我们较要综述了目前国内外结核潜伏感染的诊断方法及其新进展。     

ABCA2基因mRNA在结核分枝杆菌不同感染阶段的表达及其作为诊断标志物的研究

摘要 目的：比较ATP结合转运蛋白A2（ATP-binding cassette transporterA2,ABCA2）基因mRNA在活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染状态下的表达差异及其作为诊断标志物的能力。方法：收集活动性结核病患者、结核分枝杆菌潜伏感染者和健康人外周血,荧光定量PCR检测受试者外周血单个核细胞中ABCA2的mRNA水平,统计学分析各组ABCA2基因表达差异,及其鉴别活动性结核和潜伏感染的能力。结果：活动性结核病患者外周血单个核细胞中ABCA2的mRNA表达显著低于潜伏感染者和健康人（（H=83.38,P＜0.0001）。ABCA2鉴别诊断活动性结核和潜伏感染的曲线下面积为0.9235,灵敏度为73.53%（95%的置信区间为63.87%~81.78%）,特异性为93.55%（95%的置信区间为78.58%~99.21%）。结论：外周血单个核细胞中ABCA2基因mRNA是鉴别活动性结核病和潜伏感染者的潜在标志物,有助于活动性结核病的辅助诊断。     

糖尿病肝脏基因表达谱代谢学分析

目的:探讨糖尿病患者肝脏与正常对照肝脏基因表达谱的变化,并进行代谢通路生物信息学分析.方法:应用Affymetrix的Human Genome U133A array芯片检测糖尿病肝脏组织(n=2)和正常对照肝脏组织(n=2)的基因表达谱变化,通过DAVID分析平台对芯片监测到的表达上调的基因进行KEGG通路分析,并用RT-PCR验证部分基因的表达情况.结果:以比值大于2或小于-2为准,共有492条基因明显上调,820条基因明显下调;在差异表达明显的前20位基因中,涉及氧化应激、免疫炎症反应和脂代谢.KEC-G代谢通路分析显示:该差异表达基因谱符合2型糖尿病的发病机制,其差异表达明显基因的代谢通路涉及胰岛素信号通路、脂代谢、补体和凝血系统、糖代谢、粘附功能和细胞因子和受体的相互作用.RT-PCR证实差异表达明显基因SOD2mRNA和CRPmRNA确实表达明显上调.结论:糖尿病肝脏与正常肝脏组织基因表达谱的变化在代谢通路上主要表现为在糖、脂代谢和胰岛素信号通路、补体和凝血系统等的改变,肝脏在糖尿病发病机制中的作用可能与其参与糖脂代谢和胰岛素的作用异常有关.     

HIV-1感染者中全血miRNA表达谱的变化

初步了解HIV-1感染者全血中miRNA表达谱的变化。使用Taqman低密度miRNA表达谱芯片,分别检测10例HIV-1感染者和10例未感染者全血样本中754条miRNA的表达情况。通过BRB分析软件对样本中miR-NAs的表达情况进行比较,筛选出差异表达的miRNA。使用DIANA在线工具预测差异表达miRNAs的靶基因和细胞功能。筛选结果显示有56条miRNAs显著差异表达(P<0.001),其中有49条miRNAs在感染者中下调,7条miRNAs的表达上调。差异表达miRNAs的靶基因涉及的生物学功能相对集中,主要富集在MAPK、TGF-be-ta、Wnt等信号通路。提示:HIV-1感染引起全血中部分miRNAs表达情况的改变。56条显著差异表达的miRNA可能有着重要的作用,对这些miRNA的进一步研究有望发现新的与致病机制相关的关键分子和HIV-1感染诊断潜在的标志物。     

生物信息学分析筛选结直肠癌靶基因及评估预后价值

为寻找与结直肠癌发展和预后相关的潜在关键基因及信号通路。从美国国立信息中心NCBI的GEO数据库获得结直肠癌基因表达数据集GSE106582,通过PCA对样本进行分组,利用GEO2R进行综合分析,筛选结直肠癌与癌旁对照组的差异表达基因;通过DAVID在线工具对差异表达基因进行GO本体分析和KEGG通路富集分析,初步分析差异表达基因的生物学作用;基于STRING数据库对差异表达基因进行蛋白质相互作用网络分析,利用Cytoscape软件进行可视化并筛选关键基因;用生存分析和ROC曲线诊断对关键基因进行鉴定并通过数据集GSE21510进行验证。共鉴定出199个差异表达基因,其中53个为上调基因,146个为下调基因;上调的差异表达基因主要富集在与胶原蛋白分解代谢过程、细胞外基质分解、细胞外基质受体相互作用和PI3K/AKT信号通路等生物学过程;下调的差异表达基因主要富集在碳酸氢盐运输、一碳代谢过程、矿物质吸收、药物代谢-细胞色素P450和氮代谢通路等生物学过程;MCODE分析、生存分析和ROC诊断共发现3个基因分别为BGN、COL1A2和TIMP1可能与结直肠癌的发生发展有关,它们在肿瘤组织中的异常高表达与患者较差的生存期呈正相关,GSE21510的验证结果与GSE106582的分析结果相同。本研究采用生物信息学方法对CRC基因芯片数据进行挖掘,从基因水平探讨CRC潜在的发病机制、肿瘤标志物的及患者预后分子的筛选,以及可能的药物治疗靶点提供了一定的参考价值和理论基础。     

马立克病病毒pUL56蛋白对DF-1细胞免疫通路相关基因的转录调控研究

马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）UL56基因编码α-疱疹病毒同源蛋白pUL56。为全面了解该病毒蛋白与宿主细胞的互作关系,本研究首先将表达红色荧光蛋白标记的MDV pUL56质粒转染鸡DF-1细胞系,瞬时表达蛋白的细胞经流式细胞术分选,富集阳性细胞群进行高通量测序及mRNA转录组分析。测序结果显示,表达pUL56的DF-1细胞存在914个差异表达基因,其中462个上调,452个下调。通过GO、KEGG和Reactome通路富集分析,发现富集的显著差异表达基因分布于先天性免疫反应、细胞因子产生等相关信号通路。在此基础上,随机选取了I型干扰素信号通路和促炎症细胞因子基因进行RT-qPCR验证,IFI6、IFIH1、CD83、HSP90AA1、IL-1β和IL-8L1基因的表达量均为上调,而IL-12β表达则下调,该结果与高通量测序相符。本研究提示pUL56作为非结构蛋白,可能对宿主细胞过程有广泛的调节作用。     

CRISPR/Cas系统与结核病防控新措施相关性研究

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB,以下简称结核杆菌)感染引起的结核病仍然是严重影响人类健康全球性重大传染病。全球约1/4人口是结核杆菌的潜伏感染者。2019年,世界卫生组织(Worldhealthorganization,WHO)报道全球约150万人死于结核病。深入研究结核杆菌生物学有望为结核病防控提供新工具。成簇规律性间隔短回文重复(Clusteredregularlyinterspacedshort palindromic repeats,CRISPR)/Cas是细菌免疫系统的重要成分,在结核杆菌等分枝杆菌中也广泛存在,同时,也是分枝杆菌基因编辑的重要工具。本文结合课题组研究工作,综述了结核杆菌III-A型CRISPR/Cas系统各组分的生物学功能以及与致病的相关性,CRISPR/Cas编辑工具在诊断治疗耐药结核杆菌和结核病防控新措施中的进展。     

分枝杆菌Lsr2蛋白的结构、功能及其与结核病防控

结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis,M.tb)感染引起的传染病,目前对于结核潜伏感染状态的维持和防止再激活成为结核病防控的关注热点和研究方向。Lsr2属于M.tb中的拟核结合蛋白,具有H-NS样结构域,在M.tb对氧浓度变化的适应中具有重要作用。作为一个全局性的转录调控因子,Lsr2调控结核分枝杆菌的蛋白表达,参与潜伏感染状态的维持,并可能成为针对活动性结核病和结核潜伏感染的候选靶抗原。现围绕Lsr2的生物学特性和在结核病防控中的意义进行论述。     

治疗性结核病疫苗研究进展

治疗性结核病疫苗主要用于接种已感染结核分枝杆菌的个体,包括化学药物治疗的患者和潜伏感染者。治疗性疫苗可逆转发生在疾病进展期的非保护性免疫反应,使其向Th1型反应发展;能打破机体的免疫耐受,有效激发宿主针对结核分枝杆菌的以抗原为基础的细胞免疫反应,诱发抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应,来清除胞内寄生的结核分枝杆菌。治疗性疫苗将有助于防止潜伏结核病的复发;与药物联合使用以提高药物的治疗效果,尤其是针对耐药结核病的治疗。     

RASSF1A对黑色素瘤A375细胞基因网络的影响

RASSF1A(Ras association domain family 1 isoform A)是定位于染色体3p21.3区域的抑瘤基因,编码一个由340个氨基酸残基构成的微管相关蛋白.该基因在包括恶性黑色素瘤在内的多种肿瘤中因启动子高甲基化而表达沉默.本研究建立了RASSF1A稳定表达的恶性黑色素瘤A375细胞系,通过全基因组表达谱基因芯片分析RASSF1A过表达对A375细胞基因表达谱的影响,发现RASSF1A引起184个基因表达上调,26个基因表达下调.通过Realtime RT-PCR对部分差异表达基因进行验证,结果表明与芯片筛选结果一致.RASSF1A影响的差异表达基因功能上归属于细胞生长与增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞间黏附、信号传导等生物过程.采用STRING软件构建了RASSF1A影响的差异表达基因调控网络,结果表明RASSF1A调控的差异表达基因构成一个高连接度的基因网络.其中,炎症细胞因子、转录因子位于网络中央.RASSF1A通过影响炎症细胞因子与转录因子之间的表达,影响A375细胞基因网络,调节黑色素瘤恶性生物学行为.     

利用表达谱基因芯片筛选溃疡性结肠炎差异表达基因

目的:利用人类全基因组表达谱芯片技术,分析溃疡性结肠炎患者和健康者基因表达谱差异,筛选出溃疡性结肠炎相关基因。方法:采用Trizol法提取8例溃疡性结肠炎患者和8例健康对照者结肠粘膜组织总RNA并纯化,逆转录合成c DNA,利用荧光染料Cy3标记aa UTP,转录合成标记的c RNA,并与Agilent人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验计算筛选出相关差异表达基因,采用DAVID在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,并对部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。结果:筛查出溃疡性结肠炎结肠粘膜组织差异表达基因4132个,其中上调基因2004个,下调基因2128个。选取6条差异表达基因进行PCR验证,结果有3条基因表达上调,3条基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致。结论:溃疡性结肠炎患者与健康对照者基因表达存在明显差异,分析这些差异表达基因有助于我们探索溃疡性结肠炎的发病机制,为疾病的治疗提供理论依据。     

大肠癌转移相关分子标签的筛选

目的:筛选与转移相关的大肠癌分子标签.方法:本文通过对大肠癌表达谱数据进行分析,按照表达谱中大肠癌转移情况,组织学分化程度以及患者生存时间进行显著性分析,将与大肠癌转移相关的具有显著性意义的基因群进行聚类,通过主成分分析以及自组织映射的方法计算出差异表达基因中,起着主体分类作用的基因群.结果:筛选出与肿瘤组织分化程度以及患者生存时间相关的差异表达基因,进行功能富集,并筛选出了一批与大肠癌转移密切相关的重要基因,这些基因对大肠癌早期诊断,及时治疗,预后评估有着重要意义.结论:细胞代谢,趋化因子信号通路和细胞因子受体等分子事件与大肠癌分化程度密切相关,是否发生转移与大肠癌的预后生存期密切相关.     

高通量测序技术分析急性髓系白血病血浆外泌体微RNA表达谱差异

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,目前的诊断方法不利于疾病的早期发现,且诊断结果重复性较差。已有大量研究显示,细胞外microRNA（miRNA或miR）富集在外泌体（exosome）中,且受其表面膜的保护而具有很好的稳定性,是理想的分子标志物。目前,多种实体肿瘤均已检测到肿瘤特异性外泌体miRNA(exosomal miRNA)。然而,在AML患者中未见此外泌体miRNA报道。本研究探讨急性髓系白血病血浆外泌体miRNA表达谱差异及新miRNA序列。采用solexa高通量测序技术对7例AML患者（AML组）及7例健康对照者（对照组）血浆外泌体miRNAs进行测序,利用Mireap预测软件进行新miRNAs分析,通过edger差异分析软件筛选组间差异miRNA,获得211个已知的差异表达miRNAs以及2个新miRNAs,选择4个差异表达的miRNAs：miR-155-5p、miR-335-5p、miR-451a及xxx-m0038 5p（新miRNA）,在两组（各23例）的血浆外泌体样本中,进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证,验证结果与测序结果一致。对差异表达的外泌体miRNA进行靶基因预测及其GO（Gene Ontology）和信号通路富集分析,发现靶基因聚集的生物学功能多数参与生物进展过程的调控。靶基因主要富集在FoxO、MAPK、Hippo信号通路以及HTLV-I感染等。结果显示,AML患者与健康对照者的血浆外泌体miRNA存在着差异性表达。差异性表达的miRNA特异性很高,对进一步阐明AML白血病发生与发展的分子机制、研发新的无创诊断方法、新的诊断标记物和有效治疗AML的方法具有十分重要和深远的意义。     

IgA 肾病患者与膜性肾病患者外周血单核细胞mRNA分析

为了寻找诊断、鉴别IgA肾病(IgAN)和膜性肾病(MN)的血液特异性标记物,利用公共数据库中的IgAN和MN患者的外周血单核细胞(PBMCs)的转录组表达谱数据集识别特异性生物标记物,为诊断和鉴别提供简便、可靠的依据补充。从公共基因表达数据库(GEO)下载IgAN患者组(n=15)和MN患者组(n=8)芯片数据集,筛选前250个差异表达基因(DEGs)。通过分析筛选关键基因和途径,进行基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析和蛋白质与蛋白质相互作用关系(PPI)分析等进一步了解DEGs。通过分析共发现75个显著DEGs,其中73个上调基因,2个下调基因。GO富集分析的生物学过程(BP)主要包括蛋白质转运、内溶酶体到溶酶体转运、趋化因子介导的信号通路作用等。显著富集差异表达基因KEGG通路分析包括Endocytosis和Hepatitis B的相关信号通路。PPI筛选出EPS15、STAT4、CCL2、SUN2、SEC24C、SEC31A、GOLGB1、F2R,RAB12和PTK2B等关键基因。成功筛选出核心差异表达基因,为IgAN和MN的诊断和鉴别提供简便、可靠的依据补充,甚至提供治疗的新靶点。     

基于表达谱芯片和下一代测序技术筛选先天性心脏病胎儿心肌组织差异表达的miRNA

目的 联合采用表达谱芯片和下一代测序技术同时高通量筛选先天性心脏病胎儿心肌组织表达差异的miRNA.方法 实验组为孕中期先天性畸形胎儿,对照组为同胎龄无心脏畸形的难免流产的胎儿,取胎儿心室心肌组织,联合采用Agilent Human 2.0 microRNAs表达谱芯片和SOLiD下一代测序技术同时观察心肌组织microRNA的表达变化,数据采用生物信息学方法进行分析,并用实时PCR方法验证芯片结果.结果 通过差异miRNA筛选,发现先天性心脏畸形组在表达谱芯片和下一代测序中共同差异的24个miRNA,生物信息学预测到1 606个靶基因,靶基因Gene Ontology分析表明其中与细胞进程、代谢过程、生物调控相关的靶基因为主,Pathway显著性分析表明,部分靶基因为生物信号通路中的关键因子;随机挑选共同表达差异的4个miRNA进行验证,结果表明定量PCR检测结果与芯片与下一代测序共同筛选结果基本相符.结论 这些在先天性心脏病中异常表达的miRNA为研究先天性心脏病分子水平上的发病机制提供了重要的线索,将有可能为心脏相关疾病的诊断和治疗提供新的靶点和研发新的药物.     

基于蛋白质互作网络的COVID-19对肺动脉高压的影响机制

通过构建肺动脉高压差异基因和冠状病毒侵入人体后免疫反应相关基因的互作网络,探索COVID-19对肺动脉高压的影响机制。首先通过Meta分析挖掘肺动脉高压相关差异表达基因;其次通过SARS-CoV侵染人体后的基因表达数据,挖掘主要功能通路;最后构建肺动脉高压差异表达基因和冠状病毒主要功能通路基因的互作网络,挖掘网络的显著功能模块。发现肺动脉高压与血管平滑肌细胞、成纤细胞、T/B细胞免疫过程、转录调节因子通路、Toll样信号通路等密切相关,互作网络发现ITGAM、HBB、VCAM1、IL1R2等基因是COVID-19感染肺动脉高压患者的重要调节基因。通过肺动脉高压与冠状病毒感染机体后蛋白质互作网络探索了COVID-19对肺动脉高压的影响机制,为肺动脉高压感染COVID-19的研究及治疗提供了新思路。     

结核分枝杆菌入侵诱导的人巨噬细胞全局性基因表达变化

利用含有12800个基因全长或部分序列的基因芯片研究结核分枝杆菌无毒株入侵导致的人巨噬细胞U937全基因组在转录水平的表达谱变化. 结果表明其中473个基因(3.7%)差异表达, 表达上调的基因25个(5.3%), 上调超过3倍的包括丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶, 可溶性结合半乳糖苷的凝集素, 蛋白质酪氨酸磷酸酶delta, DDR受体酪氨酸激酶等的编码基因, 其余基因(94.7%)表达下调. 表达下调的基因中, 表达仅为原来1/3以下的25个, 其中syndecan 结合蛋白的表达下调12.5倍. 芯片研究结果与结核分枝杆菌一般抑制宿主细胞免疫应答的趋势相符. 这473个基因中的376个基因在GenBank中有记录, 另外97个是新基因. 生物信息学分析提示差异表达基因编码产物与细胞内信号传导、细胞因子反应、细胞骨架重建、细胞凋亡、铁代谢、电子传递、线粒体功能和离子通道等有关. 这些差异表达基因中, 有17个是文献报道过的, 而且都印证了本文的结果. RT-PCR和Northern杂交实验确证了表达谱芯片研究结果. 通过DNA芯片研究全局表达谱变化, 揭示了细菌入侵早期导致的巨噬细胞表达变化, 为深入研究结核分枝杆菌-宿主相互作用提供了基础数据和探索方向.     

细胞因子和microRNA与结核分枝杆菌感染的研究进展

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质,其作为细胞间信号传递分子,主要参与调节免疫应答、免疫细胞分化发育、组织修复、介导炎症反应、刺激造血功能等。micro RNA(mi RNA)是存在于真核细胞内的一种非编码小RNA,可以调控基因转录后的表达,同时还可作为不同生理和病理状态的分子标记。许多研究表明,细胞因子相关基因的多态性与结核感染、肺结核发病易感性密切相关,而mi RNA在肺部疾病的正负调节功能与肺部疾病感染的发生、发展、转化与治疗有关。我们简要叙述了细胞因子、mi RNA与结核分枝杆菌感染三者之间的关联,以期有利于及时筛查潜伏结核感染和肺结核患者,降低结核感染率和发病率。     

结核分枝杆菌Rv2626c诱导的细胞免疫应答特性

全球有近1/4的人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)并长期处于潜伏感染状态。Rv2626c是结核分枝杆菌受DosR调控的重要潜伏感染相关蛋白。本研究对Rv2626c蛋白进行了原核表达和纯化,并以RAW264.7细胞和小鼠为感染模型,对其免疫生物学特性进行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,Rv2626c-His融合蛋白主要以可溶形式表达,能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异性免疫反应。此外,本研究发现Rv2626c蛋白能结合到巨噬细胞RAW 264.7表面并上调细胞NO的生成;显著诱导促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和MCP-1的产生;并能诱导小鼠产生更强的Th1免疫应答。上述研究有利于揭示结核分枝杆菌的致病机制,为新型结核病疫苗的研制奠定了理论基础。