噬菌体T4诱导的核糖核酸(RNA)连接酶的分离和纯化

本文介绍了一种可以同时提取多核苷酸激酶(利用硫酸链霉素沉淀部分)DNA连接酶(DE一52柱层析峰I)和RNA连接酶(DE-52柱层析峰III)的方法。RNA连接酶的分离纯化步骤,除粗酶提取与DEAE纤维素柱层析两步与DNA连接酶的分离纯化方法一样外,以后只要再经过羟基磷灰石柱层析,葡聚糖凝胶(sc曲adex-G 100)过滤,和单链DNA琼酯糖凝胶亲和层析三步就可以达到纯化的目的。最终酶浓度达到每毫升24,800交换单位,即500个标准连接单位。用’H标记的聚腺苷酸作底物测不出Rnase杂酶活力,而且成功地应用于核糖十二核苷酸和十六核苷酸的定向合成。此外还做了一些初步的连接试验,表明RNA连接酶对受体寡核苷酸中戊糖是核糖还是脱氧核糖有较明显的专一性,对受体寡核苷酸的组成和顺序有一定的选择性。5'-脱氧胸腺嘧啶寡核苷酸d(pT)。也是个相当好的供体。     

双链核糖核酸病毒的研究IV．家蚕细胞质多角体病毒mRNA的体外合成

本文报道以四种核苷三磷酸为底物,在磷酸丙酮酸、丙酮酸激酶、皂土及S-腺嘌呤核苷-L-甲硫氨酸(以下简称SAM)存在下,在体外复制家蚕细胞质多角体病毒(简称CPV)mRNA,用DEAE-Sephadex A-25柱层析分离复制产物。并对体外合成的mRNA的性质进行了研究,表明是单链大分子的RNA。用电镜观察经复制后的家蚕细胞质多角体病毒,仍是含有核酸的颗粒。     

甲胎蛋白(AFP)信息核糖核酸的纯化——Ⅱ.人胚肝和正常大鼠肝信息核糖核酸(mRNA)的制备

应用寡聚胸腺嘧啶纤维素(简称OdC)柱层析从哺乳动物RNA样品中提取mRNA已被人们普遍采纳。这一方法首先需要用改良的酚-氯仿法提取总RNA,然后再经OdC柱层析分离得到mRNA(下称此法为间接法)。近年来,有人用0.5％十二烷基磺酸纳(SDS)解聚多聚核糖核蛋白体(简称多聚核糖体)后,直接经OdC柱层析分离某些mRNA获得成功。据报道这一方法(下称直接法)具有条件温和、产率较高及不影响翻译活力等特点。     

绿豆子叶脱分化过程中RNA聚合酶的制备、特性及其活性的研究

绿豆(Phaseolus vadiatus L.)子叶切段在脱分化形成愈伤组织过程中,制备的染色质具有较高的RNA聚合酶活力,3天愈伤组织的酶活力高于5天和7天的;3天、5天和7天加激素脱柱依次分分化形成的愈伤组织,其酶活力均比不脱分化的高一倍以上, 用DEAE —纤维素酶部,依据层析洗脱性质和层析图谱及对d—鹅膏菌素的敏感程度,证明三个峰是RNA聚合I,II和III。     

高速逆流色谱法分离纯化丹参并尝试制订中药指纹图谱

用国产高速逆流色谱（HSCCC）分离纯化中草药——丹参,选用正己烷乙醇水体系,固定相保留率达到788%。采用分步洗脱,3个产地丹参各分离得到12个洗脱组分,经高效液相色谱仪和紫外光谱仪检测证明3张HSCCC洗脱图谱中对应洗脱峰为同一组分。HSCCC洗脱图谱不包含非共有峰,并且对应洗脱峰保留时间的相对标准偏差RSD<3%,符合国家标准关于制订指纹图谱方法学考察资料的技术参数。因此,HSCCC作为制订指纹图谱的方法之一具有可行性。     

绿豆子叶脱分化过程中RNA聚合酶的制备、特性及其活性的研究

绿豆(Phaseolus vadiatus L.)子叶切段在脱分化形成愈伤组织过程中,制备的染色质具有较高的RNA聚合酶活力;3天愈伤组绢的酶活力高于5天和7天的;3天、5天和7天加激素脱柱依次分分化形成的愈伤组织,其酶活力均比不脱分化的高一倍以上;用DEAE-纤维素酶部,依据层析洗脱性质和层析图谱及对α-鹅膏菌素的敏感程度,证明三个峰是RNA聚合Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。     

常用的核糖核酸制备条件对牛胰核糖核酸酶活力的影响

(1)RNA的存在与否对牛胰RNase在酚水两相体系中的分配性质有决定性的影响。(2)6%以上的苯酚基本上抑制了RNase的活力,加入鼠肝匀浆,抑制作用不变。但用乙醚将苯酚除去后,RNaso活力可以恢复。(3)水层中的RNase能和RNA、DNA或白蛋白一同为乙醇所沉淀。RNase也能和RNA为1M氯化钠所共沉。(4)比较了几种常用的RNA制备方法对牛胰RNase活力的影响。磺酸十二酯钠和苯酚相似,是RNase的可逆抑制剂,膨润土是除去RNase的良好材料。(5)对文献上RNA样品不稳定的原因进行了分析。     

水稻叶片硝酸还原酶mRNA的体外翻译

水稻叶片总RNA经Oligo(dT)—Cellulose柱层析分离Poly(A)~+RNA。在往层析中采用变温洗脱的方法,可减少rRNA的混杂,提高mRNA的纯度和体外翻译活力。它对麦胚无细胞系统蛋白质合成的促进可稳定在10倍,有时高达20多倍。NR—mRNA的体外翻译产物可用以NR为载体的火箭免疫电泳方法进行鉴定,其量可用火箭峰内的放射强度来表示。     

蛇岛产蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒的柱层析分离及各组分的生理活性测定

应用二乙氨基乙基葡聚糖A—50(DEAE-Sephadex A—50)和盐浓度直线梯度洗脱的方法,对蛇岛产蝮蛇毒进行了柱层析分离,获得16个蛋白峰,并对柱层析的各组分进行了致死活性、出血活性、徐缓激肽释放活性及7种酶活力的测定。     

高速逆流色谱用于天然产物分离和指纹图谱构建

利用国产高速逆流色谱分离纯化雪莲黄酮类成分和丹参醌类成分。雪莲分离选用氯仿 甲醇 水 (10∶7∶3)体系 ,固定相保留率 72 % ,仪器参数 80 0r min 2mL min ,采用一步洗脱法 ,7h内得到 14个组分 ;丹参分离选用正己烷 乙醇 水 (10∶5 5∶4 5 )体系 ,固定相保留率达到 78 8% ,采用分步洗脱 ,3个产地丹参在 13h内各分离得到 12个洗脱组分。HSCCC洗脱图谱可以表现出不同产地丹参的差别 ,并且各对应洗脱峰保留时间的相对标准偏差 <3% ,因此提出将HSCCC作为构建中药指纹图谱的方法之一 ,其可行性需要通过与常规的指纹图谱构建方法比较之后做出评价。     

蛇毒的研究和利用 Ⅱ.湖南产眼镜蛇毒(Naja naja atra)的柱层析分离及各组分的毒性和酶活力测定

应用羧甲基葡聚糖C-25和盐浓度直线梯度洗脱的方法,对湖南产眼镜蛇毒进行了柱层析分离,获得14个蛋白峰,并对柱层析的各组分进行了毒性和酶活性的测定。     

离子交换层析初步分离大鼠肝蛋白水解酶、ADAMs、ACP、AKP和PCNA

用DEAE 离子交换层析法分离 2 /3肝切除 ( partialhepatectomy ,PH)后恢复 4、 3 6和 14 4h的大鼠再生肝及正常肝的蛋白水解酶、ADAMs、ACP、AKP和PCNA ;用SDS PAGE、Western blot、酶复性电泳等方法 ,分析了它们在不同洗脱段中的分布及活性变化 ,为分离与肝再生有关的蛋白 (酶 )提供了资料。     

粘虫肠道蛋白酶在苏芸金杆菌肯尼亚变种“7404”晶体致病中的作用

粘虫的反吐肠道液以丙酮粗提后,经葡聚糖凝胶sephadex G-75柱层析,得到两个有蛋白酶活力的洗脱峰,它们的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱完全不同,但都能水解晶体。纯晶体以反吐肠道液温培后,经Sephadex G-200柱层析,得到四个蛋白峰的层析图。经生物测定,以第二个蛋白峰的毒性最高,并在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有稳定的蛋白图谱。     

几种不同分离polyA—RNA方法的比较

本实验采用四种方法:(1)冷酚法。(2)琼脂糖凝胶2 B柱层析(3)超速离心。(4)镁离子沉淀,从大鼠肝中分离出poly A RNA。用(1)法提取总RNA,用其他方法分别抽提pRNA,再分别经Oligo(dT)—纤维素柱层析分离出poly A RNA。从A260/A280,A280/A260,A260/A230,比值、收得率、电泳行为作一比较,初步认为:冷酚法所得polg A RNA收得率较好,但有其他RNA;2 B拄层析法收得率最高,可是纯度较差;超离心法仪器昂贵,不宜普及,镁离子沉淀法则是一个操作简便而又适用的方法。     

自发性高血压大鼠多组织炎症状态

高血压是一种慢性血管性疾病,易累及肾、肝、心、脑等组织,引起脑卒中和心、肾损害等并发症.本研究对高血压时肾、肝、心、脑等组织的炎症状态进行了观察.实验采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和正常血压的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,用RT-PCR和Western blot法观察肾、肝、心、脑等组织炎症相关因子IL-1p、TNFα、ICAM-1、iNOS、C/EBPδ和PPARγ的基因表达;紫外分光光度法观察蛋白质羰基化水平和FRAP法检测组织总抗氧化能力.结果显示(1)SHR组织炎症相关因子表达较对照WKY增强,除IL-1βmRNA在肝和脑的增加不明显外,其余均有显著性差异(P＜0.05);(2)SHR和WKY大鼠肾、心、脑蛋白质羰基化水平(nmol/mg蛋白)分别为8.93±1.08和2.27±0.43、2.23±0.23和0.17±0.02、13.42±1.10和5.72±1.01,SHR明显增加(P＜0.05);而肝脏蛋白质羰基化水平无明显变化;(3)SHR肾、肝、心、脑总抗氧化能力水平显著低于WKY大鼠(P＜0.05).以上结果表明,SHR多个组织(肾、肝、心和脑)均存在炎症因子被诱导和氧化应激反应等明显的炎症状态,提示炎症可能在高血压及其并发症的病理改变中起重要作用.     

中国东方铃蟾(Bombina orientalis)皮肤中C_(-12-b)肽的分离与鉴定

东方铃蟾鲜皮的甲醇提取液,可引起大鼠离体平滑肌的收缩。此液经碱性氧化铝柱层析分离,其80%乙醇洗脱的 C 组分显示生物活性。C 组分再经葡聚糖凝胶 G-15柱分离,其活性较强的早期洗脱组分 C_(_12),可被糜蛋白酶水解灭活,但其活性并不被5-HT 拮抗剂赛庚啶[2×10~(-6)mol/L]完全拮抗。继用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析,见分离出的 C_(_12_h)峰与铃蟾肽~*(Bombesin,BBS)的出峰时间相同,且具相同的氨基酸组成。上述实验结果提示,C_(_12_h)肽可能就是铃蟾肽。     

烟草花叶病毒RNA双链复制型的分离和鉴定

用”P标记感染了TMV‘的普通烟草,从叶组织中提取总RNA,井用纤维素柱层析分离,得到了TMV-RNA的复制型。它在高离子强度下抗Rnase,在低离子强度下对Rnase敏感,并具有能自我退火和能与TMV-RNA杂交等性质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得其分子量为3．8×106。根据以上性质可以确认它是对TMV-RNA有专一性的双链RNA。     

大鼠肝tRNA~(Ⅱe)基因在大肠杆菌中的表达及分离纯化

利用T7RNA聚合酶／启动子表达系统在大肠杆菌JM109（DE3）中表达化学合成的大鼠肝tRNAⅡe基因．经酚抽提、DEAE-52离子交换柱层析及HPLC层析,分离纯化大鼠肝tRNAⅡe．变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Northern-blot鉴定表明,大鼠肝tRNAⅡe基因成功地获得表达．氨酸化活性检测表明：纯化后,每1A260单位（40μg）的tRNAⅡe可负载约650pmol的Ⅱe,纯度为54．2％．说明从大肠杆菌中分离纯化出具有一定生物学活性,一定纯度的合成基因表达产物．     

普通离子交换剂用于HPLC柱层析法快速分离眼镜王蛇毒

目的　为了经济快速分离眼镜王蛇(Ophiophagushannah,Oh)蛇毒中的毒素成分。　方法　用普通离子交换剂于高效液相色谱柱 (HPLC) TSKgel SP-Toyopearl 65 0 SF (4× 1 5 0 mm)层析法 ,实验取得最佳分离条件后 ,将蛇毒样品上柱后进行梯度洗脱 ,各洗脱峰收集后在 Cosmosil 5 C4-AR-3 0 0柱 (4 .6× 1 5 0 mm)上进行逆相 HPLC分析。非单峰组分再进行 HPLC凝胶过滤柱TSKgel Toyopearl HW-40 Fine(4× 2 5 0 mm)层析 ,层析峰组分再进行 HPLC逆相分析。　结果　眼镜王蛇毒经HPLC离子交换柱层析获得了 1 6个蛋白组分 ,其中有 5个组分经逆相 HPLC分析单一组分 ;另外的复合性组分再进行 HPLC凝胶过滤柱层析后又得到 5个单峰蛋白组分。　结论　HPLC离子交换柱层析对分离蛇毒蛋白很有实用价值 ,特别是蛇毒样品量少的情况下 (1 0 ug)也能较好分离。还具有分离时间短 (1 h左右 ) ,无须低温条件等优点。HPLC凝胶过滤柱层析可进一步使蛋白组分得到提纯     

水稻胚乳中核糖核酸的分离

核糖核酸(RNA)是分子生物学研究的重要材料之一。northern blot分析、构建cDNA库、分离基因和研究基因的转录调控都需要从细胞中分离RNA。从高等植物组织中分离高质量的RNA过程中既要防止外源核糖核酸酶的污染,同时也要注意内源核糖核酸酶的灭活。水稻胚乳细胞是种子储藏营养物质的主要部位。富含多糖类物质:如淀粉、糊精和一些低分子糖