犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性

摘要:【目的】利用真核细胞分泌表达犬细小病毒VP2蛋白和研究其特性。【方法】为构建犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）VP2基因的真核分泌型表达载体,首先通过酶切从含有人CD5信号肽序列的质粒中将CD5信号肽基因片段切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1- CD5sp载体中CD5信号肽的下游,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经磷酸钙介导转染293T细胞,使其在真核细胞中进行分泌表达,并通过ELISA检测表达的VP2蛋白与犬转铁蛋白受体（TfR）结合的活性。【结果】序列分析结果表明,本实验构建的犬细小病毒VP2基因真核分泌型表达载体结构正确,将该表达载体转染的293T细胞,在培养基中通过Western-blot检测到有VP2重组蛋白的存在。经ELISA检测表明表达的重组VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。【结论】 利用人的CD5信号肽实现了犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达,表达的VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。     

犬瘟热病毒抗原表位T’TB和犬细小病毒VP2蛋白的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

应用PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-VP2,将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位基因T'TB克隆至VP2基因的上游,命名为 pFastBacHTc-T'TB-VP2.进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带犬瘟热病毒T'TB细胞表位和犬细小病毒VP2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T'TB-VP2,将其转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T'TB-VP2蛋白,大小约为70 ku.经Western blot分析,结果显示:表达的蛋白具有良好的免疫原性.表达的重组蛋白在无佐剂参与的情况下,按确定的免疫程序免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫学指标.结果表明:表达蛋白能诱导小鼠产生抗CDV和CPV的特异性中和抗体.本实验为重组犬瘟热与犬细小病毒新型亚单位疫苗的研制奠定了重要的物质基础.     

人A组轮状病毒地方株外壳蛋白VP4的原核表达

目的：制备轮状病毒外壳蛋白VP4。方法：从病人粪便中分离的毒株中提取病毒dsRNA为模板,经RT—PCR获得编码VP4截短蛋白基因片段cDNA(1—1253bp),将VP4基因片段克隆于pGEX-4T-2融合表达载体中,经dot印迹筛出阳性重组子,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。工程菌经IPTG诱导,11％聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果：Western印迹分析表明,工程菌能正确表达VP4蛋白片段,且具有良好的抗原性。结论：为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A N端保护区在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A(SpaA)N端保护区(SpaA-N),并检测其抗原性.方法:利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spoA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),再经IFrG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化.结果:扩增得到的spaA基因长1 881 bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64 000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应.结论:获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础.     

猪细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性

将猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)vp2基因重组到杆状病毒BacToBac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastvp2质粒。在DH10Bac大肠杆菌中,pFastvp2与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)基因组(Bacmid)发生同源重组,从而获得重组穿梭载体Bacmidvp2,转染Sf9细胞得到重组病毒AcNPVvp2。SDSPAGE和Westernblotting分析可见大小约为64kD的特异性带,表明AcNPVvp2在Sf9细胞中成功地表达了PPV VP2蛋白。红细胞凝集试验和间接ELISA进一步证实,表达的VP2蛋白具有与全病毒相同的血凝活性和相似的抗原性。电镜观察VP2蛋白的粗提物,发现VP2蛋白可自行装配成许多病毒样粒子(VLPs)。     

SARS病毒S和N蛋白抗原表位的基因合成、融合表达及纯化鉴定

通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列 ,初步确定含强抗原表位的N蛋白片段和S蛋白片段 ,共 5 6 0个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子 ,化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列 ,利用基因工程技术将两个基因片段串联 ,克隆至质粒Pet2 8a(+)内的NcoⅠ/EcoRⅠ位点 ,表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) ,筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌 ,表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,部分以可溶性形式存在。经离子交换柱和反相高压液相纯化获得了表达的融合蛋白 ,经初步鉴定 ,显示该融合蛋白有较好的抗原性和特异性.     

非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段（vp73l）。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21（DE3）,经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coli BL2（DE3）高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。     

猪细小病毒VP2与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌表面共表达

将分别编码猪细小病毒(PPV)主要免疫保护性抗原VP2蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入乳酸杆菌细胞表面表达载体pPG中, 成功构建了重组表达载体pPG-VP2-LTB, 将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393, 获得了表达猪细小病毒VP2-LTB融合蛋白的重组乳酸菌表达系统, 经2%乳糖诱导, SDS-PAGE和Western-blot检测表明, 有大小约78 kD的蛋白得到了表达, 具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性, 全细胞ELISA结果表明, LTB同     

犬CTLA-4胞外区的分子克隆、表达和对犬细小病毒VP2的免疫佐剂作用

[目的]探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性.[方法]根据已发表序列设计引物,用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S,将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31;用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌,并进行诱导表达;用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠.用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平.[结果]经过30次循环PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物;序列测定结果显示,克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化:VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为98.6%:经IPTG诱导后,两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDaCTLA-4-VP2S重组蛋白,两者均能被CPV抗血清识别;间接ELISA和血凝抑制试验结果显示,CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周,抗体高峰期为初免后第4周,而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周,抗体高峰期为初免后第5周,两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍.[结论]犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生.     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白（CPVVP2）,用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母（Pichiapastoris）分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA—VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPVVP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPVVP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64．35kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPVVP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。     

口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL₂₁ (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

含Arg9的人抗HBsAg单链抗体/ EGFP融合蛋白基因的构建、表达和内化作用的研究

目的：构建、表达和纯化带有转膜结构域Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白, 并对纯化产物的亲和 活性和内化作用进行研究。 方法： 将Arg9的编码序列分别重组到ScFv14/EGFP基因的5'端或3'端或二者之间,将它们分别克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS进行诱导表达和纯化,用间接ELISA方法检测表达产物与HBsAg的亲和活性,并用间接免疫荧光检测纯化蛋白的内化活性。 结果：经测序及酶切鉴定证实四种融合基因序列完全正确.SDS-PAGE和Western blot证实四种融合基因成功表达和纯化.间接ELISA检测证实四种融合蛋白均具有HBsAg结合活性,间接免疫荧光检测显示N端带有Arg9的融合蛋白有较强的内化作用,而且不内化进入HBsAg非表达的细胞。 结论：成功构建、表达和纯化了ScFv14/EGFP融合蛋白和三种带有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白,纯化产物均具有与抗原HBsAg亲和的活性,N端带有Arg9的融合蛋白与靶细胞作用有较强的内化作用。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定

本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。     

CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (Cowpea Trypsin Inhibitor) 基因 (CpTI) 因其抗虫谱广及不易耐受等优点在植物基因工程中得到广泛应用。为进行遗传修饰食品（Genetically modified foods, GMF）中所含CpTI基因表达产物的安全性评价,我们需要在体外微生物体系中获得大量的CpTI蛋白。采用pGEX融合蛋白表达系统,将CpTI与GST的编码序列在大肠杆菌BL21中进行融合表达,表达产物达到菌体总蛋白的40%。经一步Glutathione Sephrose 4B亲和纯化,融合蛋白GSTCpTI纯度达到90％以上。将Thrombin蛋白酶与融合蛋白过夜作用,可获得切掉了GST标签的CpTI蛋白。活性测定显示GSTCpTI及CpTI蛋白均具有明显的胰蛋白酶抑制剂活性。用纯化的融合蛋白免疫家兔还可诱导产生高效价的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1∶20000。Western Blotting 实验显示,无论是菌体超声裂解后总蛋白中的CpTI蛋白或是经纯化后的CpTI蛋白均可与自制的抗体发生特异性结合。这为进一步进行CpTI蛋白的安全性评价工作奠定了良好基础。     

GST/ AEP 融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定

目的：为进一步研究抗癫痫肽（And—epilepsy peptide,AEP）的抗痫机制及筛选其相关作用蛋白,进行GST／AEP融合蛋白原核表达载体的构建及融合蛋白的表达。方法：通过PCR基因扩增对AEP基因进行扩增,并将其克隆于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）,经IPTG诱导获得表达,并采用Western Blot进行检测。结果：成功构建了AEP原核表达载体,并在大肠杆菌B121中获得表达。结论：成功构建了GST／AEP原核表达载体,并表达了GST／AEP融合蛋白。     

富含二硫键的膜蛋白p185胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达和性质鉴定

Her2/c-erbB-2基因（其产物为膜蛋白p185）是表皮生长因子受体（EGFR）基因家族的一员,在约30％的乳腺癌中发现了其过量表达。为了鉴定抗p185单克隆抗体的抗原表位并进一步研究它们的相互作用,采用PCR的方法从含Her2/c_erbB_2基因的pBabe/erbB_2质粒中扩增了p185胞外区的富含二硫键的第一、二结构域和第四个结构域。产物克隆到pGEX/4T-1载体后,转化大肠杆菌Origami B（DE3）pLysS菌株,用低浓度IPTG进行低温过夜诱导后将菌体压力破碎,SDS-PAGE检测表达上清,得到了可溶性表达的融合有GST的目的蛋白。经ELISA、Western blot等方法鉴定,可溶性表达产物具有完全的抗体结合活性,且当用凝血酶把GST切掉后该活性仍然保留。P185胞外区融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考;并为将来具有肿瘤细胞生长抑制活性的抗p185单克隆抗体的抗原表位鉴定,以及为EGFR家族受体的结构和功能关系的研究打下基础。     

生物活性肽Lunasin的原核表达和分离纯化

目的：利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法：将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果：①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论：在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。