原核表达的人乙醛脱氢酶2(ALDH2)的活性及稳定性研究

对由原核载体表达的人乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase 2,简称ALDH2)纯化工艺、酶活性改善、稳定性以及保存条件分别进行了参数的优化,以期为ALDH2商品化剂型开发提供理论依据。通过NAD(P)+酶活测定法,检测不同纯化工艺、金属离子以及不同保存条件对ALDH2的酶活性的影响。通过SDS-PAGE检测ALDH2在模拟胃液和胰液中的稳定性。结果显示,低离子磷酸盐缓冲液透析有利于ALDH2酶活性的恢复,且真空冷冻干燥处理可导致ALDH2酶活性下降。K+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+均能提高ALDH2酶活性。ALDH2在模拟胃液中稳定性良好,但在模拟胰液中迅速被降解。与此同时,ALDH2酶液在-20℃下能良好地保持其稳定性及酶活,但在4℃和30℃下保存一个月酶活急剧下降。以上结果表明,低离子磷酸盐缓冲液透析法、K+均能提高ALDH2的酶活性,同时该酶可耐受模拟胃液的降解作用,且添加山梨酸钾的ALDH2于-20℃可良好地保持其稳定性及酶活。     

硫氧还蛋白：一个肿瘤治疗的新靶点

硫氧还蛋白1（Thioredoxin-1,Trx-1）在多种肿瘤细胞和组织中均有过量的表达,它可以调节肿瘤细胞中凋亡通路、转录因子和某些功能蛋白酶的活性,进而影响着肿瘤的发生、发展、增殖、凋亡及血管发生等生理过程。而且,过量表达的Trx-1导致肿瘤细胞对多种治疗药物产生耐药性。近年来Trx-1已成为肿瘤研究的热点,是一个极有价值的肿瘤治疗的新靶点。     

两种异位心脏移植小鼠模型的建立和比较

目的比较腹部和颈部小鼠心脏移植模型的优缺点,探讨二次器官移植或双心脏移植研究的可行性和实用性动物模型。方法参照Ono法和Chen法并加以改进,建立了同系或者同种小鼠腹部和颈部异位心脏移植模型,同时对两种手术方式的成功率、手术时间、移植心脏存活时间和病理组织学进行了比较。结果腹部和颈部异位心脏移植手术成功率分别为86.7%和83.3%,两种手术方式在总手术时间、移植心脏存活时间和病理组织形态学检查上均无明显差异(P0.05)。结论在熟练掌握显微外科技术的基础上,两种异位心脏移植模型都能顺利建立,两者既可分开选用,又可结合运用,以适应不同实验需求。     

线粒体促凋亡因子Omi/HtrA2在肝癌组织中表达的研究

目的探讨丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2在肝癌组织、癌旁组织与正常肝组织中的表达及意义。方法应用免疫组化SABC法检测43例肝癌、30例癌旁组织及10例正常肝组织中Omi/HtrA2的表达。结果29例(67·44%)肝癌中Omi/HtrA2蛋白表达阳性,30例癌旁组织和10正常肝组织没有或只有少量很弱的表达。肝癌高分化组中Omi/HtrA2蛋白的表达明显高于中、低分化组(P<0·01)。另外,Omi/HtrA2表达与肿瘤大小及临床分期相关,但Omi/HtrA2表达与肝硬化、有无癌栓、HBsAg和AFP无关。结论肝细胞癌可能需要Omi/HtrA2的表达来促进凋亡,Omi/HtrA2的表达对肝癌的发展有重要作用。     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆、表达及其多克隆抗体制备

目的 制备硫氧还蛋白1 （thioredoxin-1,Trx-1）多克隆抗体.方法 从乳腺癌细胞系MCF-7中用RT-PCR的方法得到了Trx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上进行大量的表达和纯化,纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40 d后取其血清用梯度饱和硫酸铵沉淀的方法进行多克隆抗体的纯化.用ELISA和Western印迹实验测定抗体效果.结果 成功获得了Trx-1全长cDNA,通过原核表达得到了大量Trx-1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体.结论 此多克隆抗体对Trx-1蛋白具有良好的识别能力,可以应用于Trx-1的功能研究.     

实时荧光定量PCR的应用和进展

实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及近年来新兴起的荧光探针的原理、优缺点进行了评述,重点及创新点是对实时荧光定量PCR技术在动植物基因工程,微生物和医学领域的应用进行了比较全面的综述,并对实时荧光定量PCR技术的普及应用及在基因诊断领域的前景做了进一步的展望。     

丹参对鼠缺血后残肝酶组织化学的影响

研究观察鼠缺血后肝再生时酶组织化学的变化。结果表明缺血后肝再生时肝细胞ＳＤＨ、Ｇ６Ｐａｓｅ和Ｍｇ２＋ＡＴＰａｓｅ活性及ＰＡＳ反应均在不同程度上低于对照组,而ＬＤＨ、ＡＣＰ活性较对照组有不同程度升高。丹参组酶活性及ＰＡＳ反应基本处于缺血组与对照之间,说明丹参对保护某些酶活性,促进肝再生有一定的作用     

生物活性肽Lunasin的原核表达和分离纯化

目的：利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法：将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果：①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论：在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。