番茄叶片GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因表达载体的构建与转化

GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase,EC 2.7.7.22)是维生素C合成途径的第一步关键酶。通过RT-PCR扩增到1498 bp的GMPase全长序列,GenBank登录号为DQ449030。利用克隆到的基因分别构建得到正义及反义植物表达载体。并将其克隆至PBI121真核表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化烟草植株,经基因组PCR及琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明GMPase真核表达载体构建成功,并成功获得转基因植株。     

六棱大麦HVA1基因在烟草中遗传转化的研究

本研究依据HVA1基因序列克隆六棱大麦HVA1基因cDNA片段,构建Ubiquitin启动子驱动下的植物表达载体pCAMBIA1300-HVA1。然后通过三亲杂交法将重组质粒PCAMBIA1300-HVA1转入农杆菌LBA4404,并采用农杆菌介导法转化烟草。经PCR,PCR-Southern blotting和RT-PCR检测表明HVA1基因已整合进烟草基因组,并在转录水平上获得表达。功能验证的结果显示,转基因植株叶片的保水率提高了近1倍,暗示转基因烟草具有一定的抗旱潜力。     

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP PreS1 PreS2 S、PreS1 PreS2 S、PreS2 S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。     

人干扰素α-2b 基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b（Human interferon α-2b,HuIFN α-2b）编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系衣壳蛋白转基因烟草的研究

构了侵染香蕉的黄瓜花叶病毒两个株系的衣壳蛋白基因的植物表达载体,并通过农杆菌共培养法的基因枪法,分别将两个株系的ＣＰ基因转化入了两种烟草植株。其ＣＰ基因转化频率及植株再生率研究结果表明,农杆菌共培养法比基因枪法,土耳其烟比本生烟,农杆菌１：１０倍稀释液比培养原液和１：１００倍稀释液,具有更高的转化频率和植株再生能力。Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ,ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｏｌｔ检测ＣＰ基因整合研究结果     

CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

本研究的目的是将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中,利用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中,PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。     

霍乱毒素B亚单位基因分泌型表达载体的构建及转化烟草的研究

为了探索利用植物分泌特性来表达重组蛋白的可行性,先构建了含钙网蛋白信号肽的植物双元载体pBIcal,再向该载体中插入霍乱毒素B亚单位编码基因,最后得到表达载体pBIcal—ctb。通过根癌农杆菌介导,该表达载体转化烟草,在卡那霉素抗性培养基上筛选,得到30棵抗性植株。经PCR鉴定,霍乱毒素B亚单位基因已经整合到烟草基因组中。初步表达分析表明,转基因烟草中含有具生物活性的霍乱毒素B亚单位蛋白。     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.     

Arresten在烟草中的表达及其生物学活性分析

采用5'端引入His-tag的引物从携带有Arresten基因的质粒pCA中扩增血管生成抑制因子Arresten编码基因,构建其植物表达载体pCAMBIAarr并通过冻融法转化根癌农杆菌LBA4404,获得携带目的基因的重组农杆菌.采用叶盘法以重组农杆菌转化烟草,在50 μg/mL潮霉素B为选择压力下获得再生烟草植株,经过Southern杂交、RT-PCR和Western blotting检测,获得稳定整合有Arresten编码基因的烟草转基因植株.牛血管内皮细胞BCE增殖抑制实验表明,采用镍离子螯合次氨基三乙酸亲和层析法从转基因烟草叶片中分离纯化的重组Arresten蛋白具有明显的抑制牛血管内皮细胞增殖的生物活性.     

绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用(英文)

用合成的cry1Ac基因与绿色荧光蛋白基因 (GFP)构成融合蛋白基因 ,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg ,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下 ,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光 ;经抗虫试验、PCR、Southernblot和Westernblot等检测 ,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因 ,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统 ,简化了抗虫转基因植物筛选程序 ,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

根癌农杆菌介导合欢转TaNHX2基因体系的优化

通过对农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等影响转化效率的因素进行优化,建立了合欢农杆菌转化体系。在此基础上,利用农杆菌介导法将TaNHX2基因导入合欢基因组内,获得大量Kan抗性再生植株。常规PCR和实时荧光PCR检测结果表明,外源基因已整合到合欢基因组中,并正常转录。     

TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建

以TMV复制酶基因作为RNAi的靶向序列,应用RT－PCR法获得目的DNA序列。依据RNAi机制,以酶切后连接的方法将目的DNA序列正向、反向锚定连接到pUCCRNAi载体质粒,构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体;反向重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成双元载体系统的构建。每步的重组子经特异引物PCR验证和酶切验证有相应的特异条带存在,且测序鉴定序列正确。确认成功构建了TMV复制酶基因靶向的RNAi双元载体,为RNAi技术在植物病毒病害防治中的应用奠定基础。     

斑茅δ-OAT基因克隆及其序列分析

利用RT-PCR和RACE技术从斑茅（Erianthus arundinaceus）中分离出编码鸟氨酸-δ-氨基转氨酶基因的全长cDNA序列,序列全长1 680 bp,编码454个氨基酸。通过对哺乳动物、高等植物、微生物的δ-OAT基因编码的氨基酸序列进行同源比对,发现斑茅δ-OAT基因同其近缘属植物甘蔗的同源性最高（87%）,同其他高等植物的同源性次之（约为70%）,而同动物的同源性最低（约为60%）。在斑茅δ-OAT基因编码的氨基酸序列的5′端未发现线粒体定位序列,同甘蔗δ-OAT基因一样。斑茅δ-OAT基因具有完整的鸟氨酸转氨酶功能区rocD。利用定量RCR（real-time PCR）对30%PEG胁迫下的斑茅δ-OAT基因表达量进行研究,结果表明δ-OAT基因在胁迫12 h表达量达到最高,约为对照的4.1倍;胁迫2 h δ-OAT基因表达量反而有所降低。     

AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ基因对非生物胁迫的应答研究

小分子热激蛋白是植物受到热胁迫后的主要表达产物之一,与植物细胞耐热有密切关系。该研究发现,拟南芥小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ 除热激之外,重金属离子Ni⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Al³⁺均能诱导这2个热激蛋白基因的表达;氧化胁迫和渗透胁迫同样也能诱导它们表达。该研究将由CaMV35S启动子驱动的这2个小分子热激蛋白基因导入拟南芥,RT-PCR分析表明,2个小分子热激蛋白基因在转基因植物中呈现组成型表达。实验结果表明,组成型表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ的转基因植物表现出对6 μmol·L^-1 Cd²⁺胁迫、0.4% NaCl胁迫的耐受性。研究表明,这2个小分子热激蛋白基因可能参与着多种抗逆途径,推测其能够减轻或抵抗逆境胁迫引起的伤害并对其进行修复。     

ptc-miR801人工microRNA表达载体构建及功能初步研究

在构建盐胁迫下青杨microRNA文库中发现了ptc-miR801,为探索植物在盐胁迫条件下ptc-miR801参与胁迫应答的机制,本实验构建了植物表达载体pCAM2300-ami801,经根癌农杆菌EHA105介导、花序侵染法获得拟南芥转基因植株。RT-PCR半定量结果显示ptc-miR801可以在转基因拟南芥中超表达且NaCl胁迫下ptc-miRNA801转基因植株种子萌发率和根长显著高于野生型,说明ptc-miR801超表达增强了转基因拟南芥耐盐性。该试验为进一步研究miR801在杨树胁迫应答机制中的作用奠定基础。     

农杆菌介导的天绿香遗传转化影响因素的研究

通过农杆菌介导的方法将新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149导入天绿香中,对影响农杆菌转化频率的各种因素进行了研究。结果表明农杆菌介导天绿香遗传转化的潮霉素最佳筛选浓度为8 mg·L^-1,预培养时间2 d,共培养时间2 d,菌液浓度OD₆₀₀为0.2～0.25,浸染时间为8 min时适宜天绿香不定芽的诱导,有利于天绿香转基因植株的获得。通过PCR检测,初步证明外源基因Mpafp149已整合到天绿香基因组中。     

An Agrobacterium-transformed cell culture from the monocot Asparagus officinalis

Cultured stem fragments from the monocotyledonous plant Asparagus officinalis infected by the oncogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens developed tumorous proliferations. This tissue was propagated in vitro on hormone-free culture medium. The T-DNA-encoded markers nopaline and agrocinopine were unambiguously detected in these tissues. The data demonstrate that stable T-DNA transfer as well as expression of T-DNA genes is possible in at least some monocotyledonous plants. This opens new possibilities for plant genetic engineering using the Ti plasmid as a gene vector.     

白桦开花位点Flowering Locus T（FT）基因的分离及其表达

FT及其同源基因在促进植物成花和发育阶段转变过程中起重要作用。应用RT-PCR和RACE技术分离了白桦FT基因的cDNA,全长为928 bp,其开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸。预测的蛋白质分子量为19.6 kDa,理论等电点为7.73。该预测蛋白序列含有保守的PEBP蛋白结构域,命名为BplFT,并在GenBank注册,登录号为JQ409561。该基因序列同其它16种植物的相似性为74%～93%,其中与无花果（Ficus carica）的相似度最高为93%,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的相似度最低为74%,并构建了该基因序列的进化树。通过qRT-PCR的方法检测BplFT基因在白桦不同时期不同组织中的转录表达,在营养器官的表达高于花器官,成熟组织要高于幼嫩的组织,在成熟茎中的表达量最高,推测BplFT基因在成熟的营养器官发育中起重要作用,并可能参与调控次生细胞壁的形成。另外,选择了白桦雄花序突变体进行该基因的转录表达分析,该基因在突变体雌花序、雄花序、幼叶及幼茎中均为上调表达,预示着BplFT基因不仅仅参与营养组织发育,在花器官发育中也具有一定的作用。     

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43′中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。