植物功能基因组研究中的基因敲除技术

综述了T-DNA插入突变和转座子插入突变等基因敲除技术的原理及其在植物功能基因组研究中的应用,并简要介绍了向国际有关机构索要或购买拟南芥插入突变体的方法.     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记.将10株雄性大麻或10株雌性大麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池(DNApool),以提供具有相同遗传背景的雌、雄性DNA样品.每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增.在30个随机引物中,用引物401扩增得到一条约2.5kb雄性多态性片段.对该片段进行了克隆和序列分析,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)分子标记.     

植物逆境胁迫耐受性功能基因组研究进展

为了更加高效地利用基因工程技术提高植物对逆境胁迫的耐受性,需要在全基因组水平上对植物逆境胁迫耐受性的复杂机制进行整合性研究.植物逆境胁迫耐受性功能基因组的研究可概括为：利用胁迫特异性的表达序列标签(EST)及cDNA微阵列（或基因芯片）技术筛选与胁迫相关的候选基因,然后利用反向遗传学等技术对候选基因的功能进行研究,利用酵母双杂交、正向遗传学等技术对基因及基因产物间的相互关系进行研究.通过这些研究可以全面地了解植物对胁迫（渗透、干旱、极端温度）响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号转导途径,从而为更加高效地利用基因工程技术提高植物对逆境胁迫的耐受性奠定基础.     

CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子调控的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC1303-Ubi-CMO-35S-BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础.     

一个编码1，3，4—三磷酸肌醇5／6激酶类似物的拟南芥基因的克隆及其在胁迫条件下的表达分析

以对照和盐处理的拟南芥幼苗为材料,利用mRNA差异显示技术筛选得到一个受盐诱导的3′端cDNA部分序列。其相应的基因AtITL1编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物。Northem blot分析表明,该基因除受盐诱导外,还受低温诱导,但几乎不受干旱和ABA诱导,分析AtITL1基因的5′区发现存在对渗透及低温胁迫起反应而对ABA不起反应的DRE/CRT顺式作用元件。这些研究表明,编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物的拟南芥基因可能参与了ABA不依赖的胁迫信号传递途径。     

使用与Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆

与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆.为此,将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合,构建了与Gateway技术兼容的两种TA克隆载体,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆.利用兼容Gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题.     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记,将10株雄性大麻或10株雌性麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池（DNApool),以提供具有相同遗传背景的雄,雄性DNA样品。每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增,在30个随机引物中,用引物S401扩增得到一条约2．5kb雄性多态性片段,对该片段进行了克隆和序列分析 ,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR（Sequence characterized amplified regions)分子标记。     

CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

本研究的目的是将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中,利用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中,PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。