小样本情况下基因效应分析中的统计检验

基因效应分析已被广泛地应用于植物遗传学研究和植物育种工作中^[3]。根据中心极限定理,在大样本情况下,可用正态分布对基因效应和尺度测验统计量进行显著性检验。当样本容量较小时,正态分布就不能用于上述显著性检验。一些作者^[1,3,4,7]认为,在小样本情况下应当用t-统计量来进行上述检验,但实际上由于各世代间的总体方差不等,通常的t-统计量不能用于这种检验。     

云南红豆杉培养细胞系的建立

紫杉醇(Taxol)最初是从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出的一种二萜类化合物^[1]．对卵巢癌,转移性乳腺癌和恶性黑色寮瘤等患者疗效显著^[2],全世界红豆杉属植物有近11种,都含紫杉醇成分．但含量很低,加之现存数量很少,生长极为缓慢．造成了紫杉醇原料供应的危机^[3]。紫杉醇化学合成已经成功^[4-6],但繁杂的反应过程及前体化合物来源的限制使得它们无法实现商业化生产。最近从短叶红豆杉中分离出一种生产紫杉醇的内寄生真菌Tgromyer andreanae^[7]．由于紫杉醇含量仅为24～50ng/L．没有实用价值。植物细胞和组织培养可能是解决天然抗肿瘤药物长期供应的有效方法之一^[8]。自1991年Christen等人申请利用红豆杉细胞培养物生产紫杉醇专利以来^[9]．有关红豆杉细胞培养的研究已有不少报^[10-12]。但云南红豆杉(T.yunnanensis)仅见愈伤组织诱导的报道^[13]。本文报道云南红豆杉愈伤组织诱导和细胞培养的初步结果,并分析了细胞培养物中紫杉醇含量。     

P16ink4cDNA的克隆及序列分析

P16^ink4是CDK(Cyclin Dependent Kinase)抑制蛋白家族中的一员,在细胞内特异性地与CDK4和CDK6结合,抑制Cyclin D1／CDK4 和 Cyclin D1/CDK6 功能,参与调控细胞G1期至s期的转换[1,2]。1994年,Kamh和Nobon等发现在多种肿瘤细胞株中。P16^ink4基因存在突变^[3,4]。进一步的研究表明多种原发性肿瘤,比如胰腺癌、食管癌、肺癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、前列腺癌以及白血病等都发现存在P16^ink4基因的突变^[5-7]．而且家族性黑色素瘤患者中该基因存在种系突变(Germline mutation)^[8],表明该基因与黑色素瘤的发病有关。体外研究表明导入P16^ink4基因表达裁体可抑制肿瘤细胞的增殖^[9],并可抑制Ras引起的细胞增殖和转化^[10],而突变的P16^ink4则丧失了抑制Cyclin D/CDK的功能^[11.12]。这些研究结果表明P16^ink4基因可能是功能上非常重要的抑癌基因。为了研究该基因的功能。以及该基因突变与肿瘤发生、发展间的关系,我们克隆了P16^ink4基因的cDNA编码序列。     

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在甜菜转基因植株中的表达

甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,BNYVV)是一种由甜菜多粘菌(Polymyxo be tae)传播的多分体植物病毒．基因组由4～5条单链正意RNA构成^[1]。60年代末,由Tamada首次报道^[2],这种病毒可对甜菜造成严重危害,侵染甜菜后产生丛根症状(Rhizomania),并导致甜菜产量和含糖 量的大幅度下降。除欧洲、北美及日本的严重发生以外,我国自70年代以来在东北、内蒙古及西北许多省区也有大量甜菜丛根病的发生报道^[3]。由于尚无有效药剂及措施用于甜菜丛根病或病毒传播介体的防治．在我国也无法采用大面积轮作作为防治手段,所以目前在世界各地及我国上述地区甜菜丛根病的发病面积逐年扩展,对甜菜生产和制糖业造成直接威胁。针对这一情况．本文报道了含有甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的甜菜植株的转化再生工作,以期在甜菜亲本育种中获得新的抗性材料．为抗病毒品种的培育打下基础。     

植物叶绿体的摄取

遗传工程的研究方法和技术，随着现代分子遗传学的迅速发展也在不断创新^[5]。其中细胞器移植的研究，一直受到国内外遗传学工作者的重视^[8,11,12]。植物细胞比原核细胞或动物细胞在遗传操作方面具有无与伦比的潜力。去了细胞壁的球形原生质休再生成一完整植株，并诱导进行种内及种间融合产生的体细胞杂种，使育种家、遗传学家超越了有性过程的局限性，扩大了遗传重组范围，同时也为摄取细胞器、外源细胞核及核酸大分子创造了有利条件^[6,14,17]     

黑麦胚性愈伤组织和体细胞胚胎形成过程中内源IAA和Zt变化的初步研究

体细胞胚胎发生已经成为许多植物细胞全能性得以实现的主要途径,黑麦也不例外。许多报道就外源生长素物质（2,4-D、Dicamba^[1]、CPA^[2]、Picloram^[3]）、细胞分裂素类（6-BA^[4]）以及ABA^[5.6]等激素物质对体细胞胚胎发生的促进作用作了较为详细的论述。但是,阐明体细胞胚胎发生的内在原因,对这一技术的完善将具有更为实质性的意义。本试验正是基于这一思路,对黑麦体细胞胚胎发生过程中内源IAA和Zt的变化进行了初步研究。     

人纤溶酶原激活剂的抑制物2在昆虫细胞中的表达

纤溶酶原激活剂（Plasminogen Activator,PA）对血液中蛋白水解酶的活性有重要的调节作用。纤溶酶原激活剂的抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor,PAI）可物异地抑制PA（t-PA和u-PA）,其作用迅速,是PA活性的重要调节因子。很多证据表明,PAI、Pat和体内许多生理反应有密节的关系,如炎症^[1]、组织重塑^[2]、肿瘤生长及恶性细胞的转移^[3,4]等。目前已发现了四种类型的PAI,PAI-2是基中的一种,它可由人胎盘滋养层细胞合成,在孕妇血浆中大理存在^[5].该蛋白具有两种形式：一种分子量为43~47kDa的非糖基化形式：另一种分子量为58~60kDa的糖基化形式^[6,7].对其结构与功能深入的研究将有助于了解许多生于现象,但由于PAI-2基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达都不理想,不能获得足够量的该活性蛋白,本文在以轩状病毒为载体在昆虫细胞中成功地表达了该基因。     

枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

蛋白酶是枯草杆菌(Bacillus subtilis)产生的具有重要工业价值的水解酶。对蛋白酶基因的分离与高效率表达一直是基因工程研究领域的重要内容之一^[1-4]。蛋白酶基因的筛选可采用不同的方法,如“免疫法”、“DNA 杂交法”、“遗传互补法”等。大肠杆菌(Escherichia coli)是基因工程中最常用的宿主菌, 若能以E．Coli作为筛选蛋白酶基因的宿主苗,那么使用E．Coli的常规载体,便可直接获得完整的蛋白 酶基因。枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达．则是实现这一目标的关键。Koide等人^[5]报道过枯草杆菌的胞内丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。转化细胞在含有脱脂牛奶的平板上可产生十分微弱的水解圈。Ikeraara等人^[6]将Subtilisin E(枯草杆菌蛋白酶E)插人大肠杆菌的表达载体,具有活性的Subtilisin E便可分泌到大肠杆菌的细胞周质中。吴汝平撰文指出^[7]。克隆的枯草杆菌蛋白酶基因不能在大肠杆菌中表达。是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。Wang等人^[8]则认为,在大肠杆菌中观察不到野生型的中性蛋白酶基因E(nprE)的表达。是因为nprE的表达产物对大肠杆菌有致死作用．除去该基因上的核糖体结合位点,nprE便能在大肠杆菌中低水平表达,并能将表达产 物分泌至胞外。由上可知．枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达以及表达的位置仍然是一个众说纷纭的问题,这一问题也正是能否用大肠杆菌作为宿主菌筛选蛋白酶基因的关键。     

高产花色苷玫瑰茄细胞系的筛选

花色苷在植物中呈现粉红、红、紫红、紫等颜色,可以用作食品、药品及化妆品的着色剂,亦有药用价值。作为食品添加剂,颜色较合成色素自然,且安全无毒性。早在１９８７年,Ｍｉｚukami^[1]就建议用植物细胞培养物生产花色苷类代替合成色素。所有的植物培养细胞都是异源性的。各细胞之间产花色苷的能力相差很大^[2].因为产花色苷的细胞系带有颜色标记,所以容易识别并通过肉眼选择即可获得高产花色苷的细胞系。筛选的方法很多,如平板饲喂法^[3]、小细胞团法^[4]、细胞块法^[5]、肉眼观察直接挑选法及细胞分栋器法^[6]等。高产系花色苷的含量可增加几倍到几十倍,而且产量稳定。本文采用平板法及小细胞团法筛选高产花色苷的玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa L.)细胞系。     

利用 ORF438 启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白

链霉菌中表达了透明颤菌血红蛋白（VHb）,表明VHb对放线紫素的产生和菌体的生长有促进作用^[2].pIJ702质粒上带有与次生代谢有关的酪氨酸酶基因（mel）^[3],mel由ORF438启动子（P_ORF438）带动转录^[4].本文尝试利用P_ORF4328表达vgb.     

酶在有机相中催化酚类聚合的研究

酶曾-度被认为只能在水介质中起催化作用,而有机溶剂则会使其失活。由于大量化学反应都是在有机深剂中进行的,使得酶催化在有机合成中的应用受到极大限制。近年来少研究表明,只要条件合适,酶催化在有机介质中也可进行^[1.2],并已在实际应用中显示其优点,如肽的合成^[3,4]、旋光性物质的合成^[5,6]、不溶于水的化学物质的酶法分析^[7]、酯和酯交换反应^[8,9]、甾体氧化^[10]、脱氢的应^{[10]、酚类聚合反应[12].与一般化学催化相比,生物催化剂（酶）除了催化效率高,反应秉公执法曙和外,它具有亚格的选择性。例如对反应的专一性,化学基团的选择性,位置的选择性和对映选择性,因此,酶催化物别适合那些一般化学方法难以实现的手性化合物的选择性转化[13,14].}     

云南红豆杉愈伤组织培养及其生产紫杉醇的研究

从红豆杉科红豆杉属植物如短叶红豆杉（Ｔａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）等的树皮或枝叶提取到的紫杉醇（Ｔａｘ-ｏｌ）是一种具有强抗癌活性的二萜烯类化合物^[1].作为一种治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的新药已经在欧美等一些国家被批准上市,成为迄今从植物中提取的最有效的抗癌药之一^[2].但由于紫杉树皮来提取紫杉醇的方法如紫杉醇的化学合成、半合成,从真菌中提取紫杉醇以及改善红豆杉的栽培措施等等均已取得了较大进展,但离实际应用还相差太远^[5,6].而利用组织和细胞培养方法替代砍伐天然红豆杉树皮来提取紫杉醇,也已成为近几年来红豆杉研究的一个重要课题之一并已取得了较大进展^[7].云南红豆杉（Taxus yunnanensis）主要分布于我国云南省,是分布于我国的主要品种之一,其含量在我国现有的几种红豆杉植物中属于较高的一种^[3],在我国,近些年来亦有不少实验室在红豆杉细胞培养方面取得了较好的成绩,但文献报道的较少^[8-10].本文报道利用云南红豆杉细胞培养方法来生产紫杉醇,以最终取代从天然来源的树皮和枝叶中提取的可能性,对云南红豆杉进行的愈伤组织的诱导和培养研究的进展。     

重组人骨形成蛋白-3的克隆及其在大肠杆菌中的表达

骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)是一类能诱导异位骨及软骨形成,并在动物的发育和分化中起作用的蛋白质^[1,2,3]。自Urist及其同事发现骨形成蛋白以来⁴。已对8种人的BMP进行了克隆,除BMP-1外^[5],BMP-2至BMP-8均与TGF-β家族相关,它们能诱导细胞分化,促进骨、软骨及牙本质的形成^[1,6]。并在发育、分化和形成过程中起重要作用。最新的研究认为BMP-1是一种胶原蛋白酶^[7],进一步揭示了BMP家族成员的生物学作用。人的BMP-3基因定位于第4染色体上,BMP-3蛋白由472个氨基酸组成,包括N端的信号肽、中间的前肽及C端的成熟肽三部分。BMP-3的C末端与MBP-2A及BMP-2B有49％的序列相同^[5]。本实验室曾检测了BMP-3和BMP-5在不同 组织和细胞中的表达情况,发现它们在一些与骨形成无关的组织和细胞中均有表达,说明了BMP在动物和人中有着其他重要的作用^[8]。在此基础上,我们对BMP-3进行了克隆及在大肠杆菌中高效表达BMP-3-GST融合蛋白,并用Western印迹证明了其活性。     

检测蜜蜂急性麻痹病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立和初步应用

[背景] 蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus,ABPV）是一种高毒力的蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的大批死亡和蜂群衰竭。[目的] 建立一种快速、灵敏的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法。[方法] 根据ABPV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和探针,通过对引物、探针浓度和退火温度等反应条件进行优化,建立基于TaqMan探针检测ABPV的实时荧光RT-PCR方法,并对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行验证。[结果] ABPV实时荧光RT-PCR检测方法在9.8×10¹-9.8×10⁸ copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R²为0.998,扩增效率为103.8%。该方法的检测灵敏度为9.8 copies/μL;对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别为0.19%-0.80%和0.57%-1.07%,重复性良好。对2018年-2019年在福建地区采集的70份蜜蜂样品进行ABPV检测,阳性率为2.86%。[结论] 建立的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法能用于该病的实验室检测、流行病学调查和疫情监测。     

PVA固定化的生黑醋菌生产L-山梨糖的研究

生黑醋菌可以将D-山梨醇转化为L-山梨塘,用微生物将D-山梨醇氧化为L-山梨糖是维生素C生产的一个重要部分,目前工业上用的都是游离菌批式生产工艺。由于固定化活细胞作为生物催化剂具有生产的连续性和稳定性．操作简便．产物易于分离纯化等优点^[1],已有不少实验室研究甩固定化微生物细胞将D-山梨醇转化为L-山梨糖^[1-6],国内也有用海藻酸固定化生黑醋菌Acetobacteriummelanogenum的报道^[2,3]。用海藻酸钙^[1-3]、聚丙烯酰胺^[4]、铝处理的海藻酸钙^[5]、水合聚丙烯酰胺与海藻酸钙混合固定化的微生物细胞^[6]转化D-山梨醇成为L-山梨糖,都有因机械强度差,而不适合在搅拌式发酵罐中生产的弱点。聚乙烯醇制备的固定化微生物细胞具有机械强度好、类似于橡皮的弹性、成低等特性^[7]。因此,我们选择聚乙烯醇作为固定化生黑醋菌的材料。     

稻田除草剂二氯喹啉酸降解菌15#的分离、鉴定及降解特性

[背景] 二氯喹啉酸（Quinclorac,QNC）是一种高选择性、激素类、低毒性除草剂,主要用于防治稻田稗草,持效期长,易于在土壤中积累而影响后茬作物的生长发育,而且环境中残留的QNC可对动物生长发育产生不良影响,并影响微生物的群落结构和丰度。[目的] 从稻田土壤中分离筛选出一株可降解除草剂QNC的菌株,鉴定并明确其降解特性。[方法] 通过形态学、生理生化试验、磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid,PLFA）微生物鉴定、16S rRNA基因测序及分析鉴定菌株。通过单因素实验探究菌株的降解特性。[结果] 筛选得到一株编号为15^#的QNC降解菌,被鉴定为无色杆菌属菌株（Achromobacter sp.）。降解特性研究结果表明,菌株15^#的最佳培养条件为：30℃、pH为6.0、初始QNC浓度为100 mg/L、接种量为7%、添加质量分数为0.1%的酵母浸粉、氮源为蛋白胨,在此条件下培养21 d后QNC的降解率可达43.0%。[结论] 筛选到降解QNC新菌株并为该菌株的进一步研究提供理论基础。     

人神经生长因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

神经生长因子(Nerve　Growth Factor,NGF)是最早发现的生长因子之一。它对中枢和周围神经元具有存活分化效应^[1]。NGF有可能治疗Alzheimers老年痴呆病、某些周围神经病变和脊髓损伤^[2]。NGF在人体组织中含量极微,已有报道从胎盘中纯化hNGF,但其组织来源极其有限,成本高,产量低．不能满足对hNGF的需求,所以如果能利用基因工程方法获得大量有生物学活性的hNGF制品,对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。我们根据已知序列设计合成一对引物,以人基因组DNA为模板,用PCR获得hNGF基因,并构建重组表达质粒．使rehNGF在大肠杆菌中获得表达,表达产物具有免疫学和生物学活性。     

固定化技术研究的新进展

固定化生物催化剂的研究近一、二十年来发展非常迅速。它已由原来的单一固定化酶、固定化微生物细咆发展到动植物细胞、组织器官、微生物孢子^[1]、细胞与酶^[2]、好氧微生物与厌氧微生物^[3]的混合固定化等,其应用研究巳涉及发酵、食品、化工、分析、医疗、生化、环境净化等各个领域^[4],展示了广阔的发展前景。     

蓖麻蚕rDNA转录起始区核酸酶S1的敏感位点的特征结构

曾报道,蓖麻蚕rRNA基因的非转录间隔区内有1个单链核酸酶S1的超敏感位点,它具有d(AT)₁₈的特征结构^[1] .蓖麻蚕经饥饿,再食后.发现在该S1超敏感位点的下游还存在1个敏感位点,而在饥饿的情况下,未能检测到染色质上的这个敏感位点^[2].新确定的这个可诱导的单链核酸酶的敏感位点,它是一个d(GT)₁₀…d(AT)₁₀的特殊结构,具有易解链的特征.这个新确定的核酸酶S1的敏感点结构可能直接参与了rDNA的转录和复制的调控.     

TRPO-AOT 反胶团体系萃取牛血红蛋白的研究

反胶团是表面活性剂溶解在非极性溶剂中形成的、围绕一个“水核”的纳米级聚集体。液液反胶团萃取蛋白质技术,因对目标物质选择性好、容量大和能保持其活性而得到广泛研究^[1-9].在反胶团萃取蛋白质的研究中,多数作者采用单一表面活性剂AOT^[2]或季胺盐^[3]的反胶团体系。两种体系的共同弱点是:体系受离子强度、pH值等静电因素的影响大,直接影响萃取率,为了克服它们的不足,有人在AOT体系中加亲和试剂增强反胶团对蛋白质的亲和性^[4],加磷酸类阴离子表面活性剂^[5]、天然表面活性剂磷脂^[6]等以增强体系的萃取性能e人在季胺盐的反胶团体系中加非离子表面活性剂作助剂提高蛋白质的萃取率^[7],有人则反阴、阳和非离子表面活性剂混合形成反胶团提高某种酶的萃取容量^[8],本文用中性磷氧萃取剂三烷基氧膦（TRPO）与阴离子表面活性剂琥珀二辛酯磺酸钠（AOT）混合溶解在异辛烷中形成反胶团萃取牛血红蛋白（BHb）,比较AOT、TRPO及AOT三体系对牛血红蛋白（BHb）的萃取性能。