烟草远缘杂种合子中父本特异表达基因EB30的克隆与分析

已知烟草远缘杂种的合子中EB30基因(EST序列号EB426694)的表达具有父本特异性。参考NCBI的EST序列设计引物,克隆得到该基因的CDS序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。使用染色体步移和hi TAIR-PCR技术获取EB30基因的5'侧翼序列(启动子和5'UTR)。构建由该基因5'侧翼序列驱动的EB30-EGFP融合蛋白表达载体并转化烟草。结果表明,EB30蛋白由211个氨基酸组成,蛋白分子量为22.616 2 k D,等电点p I为5.63。该蛋白具有亲水性,可能定位于线粒体中。烟草EB30蛋白与同属茄科的番茄和马铃薯的蛋白序列相似度最高,约为73%。不同物种的同源蛋白的N端和C端都具有一段较为保守的序列区段。观察转基因植株合子和二胞原胚能检测到较强荧光,证实所获EB30基因的5'侧翼序列在早期胚胎发生时期具有启动子活性。     

从烟草EST微卫星标记中筛选合子胚中优势表达的基因

为获得烟草合子胚中的优势表达基因,利用CAP3程序对来自烟草公共数据库的EST序列进行组装,利用MISA程序从组装后的EST中筛选SSR位点,将多态性的SSR位点在烟草合子文库中进行扩增并对等位基因进行分析。结果表明:具有多态性的16个SSR标记中,有9个基因能从烟草的合子库中成功扩增得到。该研究为筛选烟草合子胚中优势表达基因提供新的途径。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因5'端侧翼区域的克隆与鉴定

应用衔接头PCR技术,扩增得到约2000 bp的扩展青霉碱性脂肪酶基因5’端侧翼区域的单一产物。对该产物测序并提交GenBank数据库(GenBank accession DQ677520),经序列比对分析,发现该序列具有真核启动子序列的基本结构特征,含有TATA盒、CAAT盒、GC盒等元件。将扩增得到的脂肪酶基因5’端侧翼序列,连接到含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒中,构建了一个重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞。荧光显微观察大肠杆菌阳性转化子发出荧光,侧翼序列含有启动子功能得到确认。     

天山雪莲LEA14基因克隆及功能分析

从天山雪莲叶片低温诱导的EST文库中获得了1个胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA)cDNA全长序列。序列分析表明,该基因含有1个468bp编码155个氨基酸的开放阅读框。NCBI保守域预测此蛋白属于LEA_2家族,命名为SiLEA14。系统进化分析表明,该蛋白与北柴胡的LEA-2蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,SiLEA14表达量在低温、盐和干旱胁迫条件下迅速升高。亚细胞定位结果表明,SiLEA14蛋白定位于细胞核中。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,测定并分析转基因植株在冷冻和盐胁迫处理下的生理指标,结果表明,SiLEA14基因在烟草中的过量表达提高了烟草的抗冻和耐盐能力。     

水杨酸诱导的烟草抗性相关序列的分离

通过已分离鉴定的水杨酸诱导烟草‘云烟85’中与抗性相关的差异表达基因,采用差示筛选和反式Northern检测以及序列分析得到94个烟草差异表达的EST序列。经测序及同源性比较,其中87个有同源序列,7个为新序列;有51个与抗性相关,占总序列的54.3%,其中有系统获得抗性蛋白基因和病程相关蛋白基因等。     

GhCyt b5基因的克隆及其蛋白参与电子传递功能的分析

从陆地棉品种中棉所35盐胁迫EST文库中筛选到与其它植物高度同源的细胞色素b5蛋白(Cyt b5)基因片段,利用RACE技术,获得Cyt b5基因的cDNA序列,命名为GhCyt b5,基因全长810bp,最大阅读框402 bp,编码由134个氨基酸组成的蛋白质,分子量约为17kDa.将该基因的编码序列插入到原核表达载体pET32a中,构建重组质粒为pET32a-Cyt b5,对不同条件下进行蛋白诱导表达分析,发现在28℃和1 mmol/L IPFG条件下能够获得可溶性的GhCyt b5蛋白.利用Ni2+柱亲和层析纯化和SDS_PAGE鉴定分析表明获得重组蛋白为目的蛋白.通过提取棉花细胞物质为反应介质,进行体外电子传递功能分析,发现GhCyt b5能够从还原态变为氧化态,参与电子的传递功能.     

日本蟳高血糖激素基因的克隆与表达分析

通过RACE技术克隆获得日本蟳Charybdis japonica高血糖激素基因（CjCHH）全长cDNA序列;运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析该基因的组织差异性表达;利用原核表达技术获得CjCHH重组蛋白。序列分析表明：CjCHH cDNA全长1754 bp,包含111bp的5’末端非编码区（UTR）,423 bp的开放阅读框（ORF）,以及1236 bp的3’UTR,该基因可编码140个氨基酸。序列比对结果显示：CjCHH的成熟肽序列与其它甲壳动物CHH的一致性为41%~88%。系统进化树显示：CjCHH与其它梭子蟹科的CHH聚在一起,这与日本蟳所处的分类地位一致。组织差异性表达研究显示：CjCHH在检测的10个组织中均有表达,其中眼柄中表达量最高,肠和Y-器次之,其余组织表达量较低。成功构建了CjCHH重组表达质粒pET-CHH,并在大肠杆菌（Escherichia coli）中获得了高效表达,重组蛋白的相对分子量约11 kDa,与预测的相对分子质量大小相一致,表达水平在5 h的IPTG诱导过程中呈现上升趋势。     

数据综合分析鉴定人类Auxilin基因

Auxilin蛋白诱导Hsp70c蛋白与笼形蛋白的结合,在真核细胞衣被小泡脱衣被的过程中扮演了重要的角色.通过对已有EST,STS等数据库的综合分析,我们将人类auxilin基因定位到1p31,D1S515和D1S198标记之间.26个EST构成的5个重叠群,占该基因中共约2.3 kb的部分cDNA序列,其中编码区长501 bp,得到的序列与牛的auxilin基因显示有极高的同源性.各EST数据显示,auxilin在人胚胎的多种组织中表达,在成人脑、表皮组织中也有表达.     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

EST技术及其在哺乳动物早期胚胎研究中的应用

EST(expressed sequence tags ,EST) 是一段长约150～500 bp的基因表达的外源序列片段,是由大规模随机挑取的cDNA克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。一个EST代表生物某一时期的某种组织或细胞的一个表达基因。本文主要综述了EST技术的原理方法,哺乳动物早期胚胎研究的理论基础以及EST技术在早期胚胎研究方面的应用,并讨论了利用EST进行研究分析的发展趋势。     

人SDCT2基因的两种不同转录产物选择性转录机理分析

为了克隆人高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白 (highaffinitysodium dependentdicarboxylatetransporter,SDCT2 ,或NaDC3)基因并研究其生理功能 ,用大鼠SDCT2基因序列作为电子杂交探针对人EST数据库进行电子筛选 ,得到了一系列与大鼠SDCT2序列具有高度同源性的人EST序列 ,将它们拼接成 2个基因重叠群 ,设计特异性PCR引物通过RT PCR扩增得到 2条杂交探针用于筛选人肾cDNA文库 .从肾组织中同时克隆出了人SDCT2基因 2种mRNA变异体的全长cDNA(SDCT2α和SDCT2 β) ,两者 5′端前 3435bp序列完全一致 ,但 3′端长度不同 ,SDCT2 β在第 3435bp以后比SDCT2α多出了 5 85bp的序列 .Northern杂交和RT PCR显示 ,SDCT2α在人肾中的表达丰度最高 ,在肝、脾、胎盘、脑及结肠中也有低水平的表达 .而SDCT2 β主要在肾脏中表达 ,在脾也有低水平的表达 .基因组结构分析表明 ,虽然两种mRNAs均由 13个外显子组成 ,但是SDCT2α的第 13外显子含有 1个poly(A)加尾信号AATAAA ,而SDCT2 β的第 13外显子含有 2个poly(A)加尾信号 .这表明在肾脏和脾脏组织中 ,人SDCT2基因可能通过选择性使用位于第 13外显子不同位置的 2个poly(A)信号而转录出 2种不同长度的mRNA变异体 .     

一个血清抑制基因的克隆

比较血清培养细胞和血清饥饿细胞的基因表达差异,获得了一段血清饥饿细胞中特异表达的cDNA序列,以此序列出发,通过搜索表达序列标签(EST),拼接出完整的基因序列,通过PCR分段克隆获得全长cDNA序列.该基因全长5 429 bp,编码框预测有791个氨基酸残基.GenBank搜索,该基因与已有的细胞周期调控基因没有同源性.所以,该基因是一个新的与细胞周期有关的基因（GenBank接受号：AY050169）.由于该基因最初发现在无血清培养条件下表达,故叫血清抑制基因（serum inhibit gene,Si-1基因）.     

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因5′旁侧区近端1.2kb和远端1.6kb的片段。通过拼接,构建出含有2505bp启动子区和转录起始位点下游86bp的共2591bp的基因5′旁侧区片段;其启发性动子区中34至28为推测的TATA盒序列,158至146为推测的CCAAT盒,与其它植物基因启动子结构相类似。将2.5kb启动子片段与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达,从功能上证明了此25kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建5个含不同5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至-1111的启动子区中,而在-1111至-608区间可能存在一个正控制区。     

四翅滨藜AcDHN基因的克隆及其抗逆功能分析

脱水素（dehydrin,DHN）是一类胚胎发育后期丰富蛋白（LEA）,在植物脱水条件下能保护细胞内蛋白质和膜结构免受破坏。本研究中,从四翅滨藜（Atriplex canescens）cDNA文库克隆得到逆境胁迫相关蛋白基因AcDHN的全长cDNA（登录号：JN974246）,并进行序列分析。将4cD鼢别插入到原核表达载体pET28a和双元表达载体pYES-DEST52中,通过转化大肠杆菌和酿酒酵母进行原核表达分析和真核表达分析。结果表明：AcDHN序列全长为1408bp,完整的开放阅读框长为1017bp,由338个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子量为38.3kDa,理论等电点为6．47,AcDHN与仙人掌中DHN蛋白同源性为55％。AcDHN基因在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出分子质量约45．2kDa的融合蛋白。重组酵母菌株能表现出艮好抗逆性,特别是对NaCl、低温、Na2CO3和NaHCO3胁迫的抗逆性,其中抗碱胁迫能力表现最强。     

藏山羊KLF8基因克隆及组织表达分析

本试验旨在获得藏山羊KLF8基因序列,并分析其生物学特征,同时阐明该基因在不同组织中的表达情况。利用RT-PCR技术克隆藏山羊KLF8基因序列,利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)检测其在藏山羊各个组织中的表达丰度。结果表明,获得藏山羊KLF8基因序列1 069 bp,其中包含CDS区1 008 bp,5'UTR序列28 bp和3'UTR序列33 bp,共编码335个氨基酸,为不稳定亲水碱性蛋白。KLF8基因在藏山羊的肺脏组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(p<0.01)。本研究为进一步阐明KLF8基因在藏山羊中的生物学功能提供了依据。     

Cloning of chitinase-like protein1 cDNA from dicyemid mesozoans (Phylum: Dicyemida)

Dicyemid mesozoans are endoparasites found in the renal sacs of benthic cephalopods. Adult dicyemids insert the distinct anterior region, termed a "calotte," into renal tubules of the host. We cloned cDNA encoding chitinase-like protein from the dicyemid Dicyema japonicum (Dicyema-clp 1), and also cloned the gene fragment corresponding to the cDNA. Dicyema-clp1 has the hydrophobic amino acid-rich region, but not the chitin-binding domains at the C terminus. Analyses using the SignalP prediction program suggest this hydrophobic amino acid-rich region is the anchor sequence to plasma membranes. The putative catalytic site in glyco18 domain exhibited 1 substitution from aspartic acid to asparagine. The gene fragment had short 9 introns (22-26 bp), and the coding sequence consisted of 10 exons (30-233 bp). Specific and strong expression of Dicyema-clpl was detected in the calotte of vermiform stages by whole mount in situ hybridization. N-acetyl-D-glucosamine was detected on the outer surface of both peripheral cells of dicyemids and epidermal cells of host renal appendages. Dicyema-clp appears to be associated with N-acetyl-D-glucosamine in the interface between dicyemid peripheral cells and epidermal cells of the host renal appendage, and possibly aids in adhering the calotte to host epidermal cells.