核糖核酸酶A的s-蛋白与DNA的结合作用

核糖核酸酶A具有DNA结合蛋白的作用。本文报道,核糖核酸酶A经枯草杆菌蛋白酶作用后,被切断而形成一个20肽和s-蛋白。分离纯化后的s-蛋白完全丧失了水解RNA的酶活性,却完全保持着作为DNA结合蛋白的活性。这个结果说明核糖核酸酶A表现RNA水解酶活力与其同DNA的结合作用对结构的要求有所不同。对s-蛋白与双链及单链DNA结合作用的研究还表明,在这种结合过程中s-蛋白分子中的酪氨酸和苯丙氨酸残基的萤光发生淬灭作用,可能系因s-蛋白中的这些氨基酸残基直接参与了与DNA的结合,RNaseA经枯草杆菌蛋白酶作用切除s-肽后产生的s-蛋白的α-螺旋含量由RNaseA的17.5%增加到23.7%。     

细胞毒性RNase及其抗肿瘤活性

核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)是一类核酸水解酶,它们广泛存在于动植物中,除了具有水解RNA的活性外,有的还有一定的细胞毒性。根据结构的相似性,这些RNase属于RNase A超家族(RNase A superfamily)。RNaseA超家族包含了以牛胰核糖核酸酶为原型的不同来源的脊椎动物核糖核酸酶。细胞毒性RNase显示出抑制肿瘤细胞生长的活性,因而有望应用于肿瘤治疗中。本文对RNase A超家族中的几个成员棗核糖核酸酶A(ribonuclease A,RNaseA)、豹蛙抗癌酶(onconase,ONC)、牛蛙核糖核酸酶(Rana catesbeiana ribonuclease,RC-RNase)、牛精液核糖核酸酶(bovine seminal ribonuclease,BS-RNase)和amphinase(Amph)的结构及抗肿瘤活性进行了综述。     

黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析

以黑曲霉(A.niger)TCCC41013的总RNA作为模板,通过RT-PCR扩增出含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因,将其插入pUCm-T载体上,经PCR和酶切鉴定后进行测序并分析.所克隆的PEP基因全长为1 581bp,编码526个氨基酸残基,成熟肽为504个氨基酸残基.与GeneBank中已报道的A.niger CBS513.88的PEP序列同源性最高,达到99.75%.脯氨酸蛋白内肽酶是一种新型的丝氨酸蛋白酶,黑曲霉PEP与已克隆的其他菌种的PEP同源性不高.     

人核糖核酸酶A家族生物学功能的结构基础

人核糖核酸酶A(ribonuclease A, RNaseA)家族成员有13个，分别为RNase1-RNase13,它们具有很高的序列相似性，大多含有6～8个半胱氨酸并形成分子内二硫键，以维持特有的空间结构。其中，RNase1-RNase8具有多种生物活性，可概括为3类：涉及核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解；具有抗细菌、抗真菌和抗病毒活性；以及机体免疫调节作用。而RNase9-RNase13不具有核糖核酸酶活性。因此，本文将重点对RNaseA家族成员RNase1-RNase8的结构与功能研究进行综述，重点概述决定RNaseA生物学功能的结构特征，以期指导以RNaseA为基础的抗微生物药物开发及RNaseA在机体免疫中的功能研究。     

用固定化牛胰核糖核酸酶催化合成寡核苷酸

牛胰核糖核酸酶(RNaseA)是一个重要的核酸水解酶。1955年Heppel等人发现RNaseA在0℃有催化合成寡核苷酸作用,此后RNaseA用于合成的研究逐渐增加,但由于RNaseA是一个强水解酶,又相当稳定,故在合成产物后如何从合成产物中完全及时地将它去掉,总得不到很好的解决,因此阻碍着RNaseA在合成方面的广泛应用。为了解决去酶问题,我们参照了“高度稳定的固定化碱性磷酸酯酶”等固定化酶方法,制得了高度稳定,结合牢,不易脱落的固定化RNaseA。这对我们进一步开展对寡核苷酸的合成提供了有利的条件。接着,我们尝试了以合成嘧啶类二核苷酸为模型,对固定化RNaseA催化合成寡核苷酸进行了初步探索。并成功地合成了CpG、CpU、UpC和UpU。得率都在30%左右。     

中国林蛙Onconase样核糖核酸酶的基因克隆和表达

Onconase是从美洲豹蛙卵中提取的一种核糖核酸酶,由于其抗肿瘤活性而具有潜在的临床应用价值.以中国林蛙基因组为模板,克隆了一个新的RNase基因,并由此推导出了成熟林蛙RNase的氨基酸顺序.该酶是由103个氨基酸残基组成的,它保留了RNaseA家族成员酶催化活性必须的组氨酸和赖氨酸残基,以及CKXXNTF的序列特征,与Onconase具有73％的氨基酸顺序的相似性.林蛙酶比Onconue少一个氨基酸,成为选今为止发现的RNaseA家族中的最小成员;并且,林蛙酶拥有的精氨酸和酪氨酸残基比Onconase多3个.此外,在利用原核表达系统对林蛙RNase基因进行表达的过程中,表达产物对宿主显示出一定的细胞毒性.     

RNase A及其链亲和素融合蛋白在pET系统中的表达

在大肠杆菌中用pET28a表达载体表达重组RNaseA。变性条件下,利用His-Resin亲和纯化,得到60mg／L电泳纯的RNaseA。纯化的RNaseA复性后,利用含大量RNA分子的碱法抽提质粒为底物,测定重组RNaseA活性,与商品化的RNaseA活性相当。同时在RNaseA活性测定体系中加入4mol／L尿素会使RNA分子切割效率提高10倍左右。在此基础上,成功表达RNaseA与链亲和素(streptavidjn)的融合蛋白,经纯化复性后,该融合蛋白同时具有核酸酶、biotin结合活性,在分子生物学中具有重要的应用价值。     

工业应用上性能改进的工程酶

有四种工业上重要的酶种,经工程改造后改进了它们在工业应用上的性能。 枯草杆菌蛋白酶,通常加在洗衣粉中,去除蛋白质沾污效果很好。但漂白剂能使天然枯草杆菌蛋白酶失去活性。把解淀粉芽孢杆菌蛋白酶BPN'中对氧化敏感的222号甲硫氨酸换成抗氧化的氨基酸,如丙氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺。这种酶在1M过氧化氢中仍保持活性。另外,用亮氨酸取代217位置上的酪氨酸残基,则BPN'对合成基质的水解能力比野生型酶高10倍以上。证明只要改变一个氨基酸,就能大大改进枯草杆菌蛋白酶BPN'在洗涤剂中的应用。     

蛋白酶B.P与几种试剂蛋白酶的比较

蛋白酶B.P与国内外几种试剂蛋白酶比较,证明其酶种单一,只含有蛋白酶,不含DNA酶和RNA酶,与蛋白酶K和蛋白酶E相似。蛋白酶B.P除含有碱性蛋白酶外还含有较高的中性蛋白酶活性,它可以广泛地水解多种天然蛋白,应用于微生物细胞蛋白的水解,提取DNA和RNA,还可水解叶肉细胞蛋白,提取叶绿体DNA,是我国第一个碱性生化试剂蛋白酶。     

核糖核酸酶抑制因子对血管生成素功能的调控

血管生成素（angiogenin,ANG）能有效促进血管生成和肿瘤细胞增殖,在肿瘤发生发展中起重要作用.其主要分子机制是通过核转位和激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,刺激rRNA转录和核糖体生成.ANG也被发现在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）患者中存在基因编码区的功能突变,表明其在运动神经元生理方面发挥作用,其缺陷是神经退行性疾病的一个危险因素.核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor,RI）是胞内酸性蛋白质,由460个氨基酸残基组成,分子质量约为50 kD,当其与核糖核酸酶A（RNaseA）结合形成复合物后,可抑制RNaseA 的90％以上活性,从而有效调节细胞内RNA水平. ANG具有低核糖核酸酶活性, 是RNase超家族一员,与RNase A有着高度保守的同源顺序. 序列、结构和酶学等分析表明,RI也能够与ANG紧密结合,且得到体外实验的证明. 研究发现,RI具抑癌基因功能;RI与ANG在细胞内共定位;Co IP和GST pull down证实其相互作用,获取了RI与ANG在体内结合的直接证据;RI与AKT磷酸化表达负相关.在膀胱癌细胞及临床标本中证实了RI与 ANG和PI3K/AKT通路分子表达的相关性及与肿瘤细胞生长与转移的关系．在细胞和动物模型研究表明,RI调节ANG活性的功能及其分子机制,即RI通过结合ANG而封锁其核转位和调控PI3K/AKT/mTOR信号通路及其相关通路交互应答（cross talk）的能力,从而抑制肿瘤生长及转移. RI是一个有希望的抗肿瘤蛋白新药和血管生成抑制剂,可望成为基因治疗的靶基因.     

RNase A超家族多样性的产生及宿主防御

胰核糖核酸酶家族也被称为RNase A家族,包含了与牛胰核糖核酸酶同源的所有脊椎核糖核酸酶.从20世纪初.RNase A超家族就成为生物化学、结构生物学、酶学、进化学等领域的研究热点.最新的进化研究显示,脊椎动物RNase A家族起源于宿主防御功能,本文就RNaseA超家族多样性的产生及其宿主防御功能进行综述.     

核糖核酸酶抑制蛋白变体RIv在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达

人源的核糖核酸酶抑制蛋白 (ribonucleaseinhibitor,RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质 ,分子量为 5 0kD。从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体 (ribonucleaseinhibitorvari ant,RIv)。序列分析表明 ,与RI相比较 ,RIv序列中仅有Arg359Ala和Leu36 5Pro两个氨基酸突变 ,而核苷酸同源性较低 ,为 78%。将RIv克隆于pET2 8a( ) ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,利用 6×His亲和层析柱纯化得到了His RIv重组蛋白。将RIv克隆于转移载体pBacPAK8,利用家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)表达系统表达得到重组RIv。体外活性测定实验表明 ,重组RIv具有抑制牛胰RNaseA酶解 2 8S和 18SrRNA的作用。     

天蚕素A-马盖宁杂合肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生理代谢影响的研究

研究天蚕素A-马盖宁杂合肽作用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)后对细胞生理代谢的影响。利用全波长酶标仪测定杂合肽作用MRSA后对DNA、RNA、总蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶的影响,利用溶氧电极测定杂合肽对细胞呼吸作用的影响,通过生物发光分析仪检测杂合肽作用细胞后ATP生产的变化。结果显示,杂合肽作用MRSA后对细胞DNA、RNA、总蛋白的合成能力均出现抑制作用。β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶的表达活性同样受到了明显的抑制。杂合肽作用细胞后呼吸作用明显下降,ATP生产能力受到抑制。杂合肽作用细胞后抑制了胞内部分生物大分子的合成能力、胞内酶的表达活性及细胞的能量代谢功能,通过胞内机制发挥了抑菌作用。     

黑翅土白蚁基因组DNA提取方法的优化

目的 为快速地提取到质量较好的黑翅土白蚁基因组DNA进行白蚁种群多样性的研究,对基因组DNA提取方法进行了比较与改进.方法 先初步采取CTAB法与蛋白酶K法对黑翅土白蚁基因组DNA的提取方法进行比较,再利用正交设计法对蛋白酶K法中裂解液、蛋白酶、RNA酶及作用时间4个因素进行优化.结果 蛋白酶K法获得的基因组DNA的质量与产量稍优于CTAB法;较佳的提取步骤组合为:裂解液150 μL,蛋白酶K 6μL,作用时间1h,RNA酶可不添加.结论 采用优化后的方法获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到了清晰、稳定的扩增谱带,完全可用于相关后续实验.     

yapsin蛋白酶家族研究进展

yapsin蛋白酶是一类糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的天冬氨酸蛋白酶,能特异性地切割底物中的单或双碱性氨基酸残基位点,起着加工前肽的作用。近年来研究发现,工程菌表达某些外源蛋白时发生的降解现象与yapsin蛋白酶有紧密的关系。概述了yapsin蛋白酶家族的命名、结构、定位、酶原激活、基因表达及底物特异性和功能。     

松鼠胰腺型核糖核酸酶A基因的克隆与表达

核糖核酸酶A(ribonucleases A,RNases A)构成一个大家族,其成员表现出不同程度的水解RNA的酶活性。一些成员还表现出特殊的生物学活性。旨在克隆松鼠核糖核酸酶A的基因,利用原核细胞系统表达重组蛋白,并进行初步的酶学性质的研究。结果表明,所克隆的基因属于核糖核酸酶A家族,保留了核糖核酸酶A家族酶活性必要的保守序列。进化分析表明,该基因属于松鼠胰腺型核糖核酸酶基因,与其它啮齿类动物胰腺型酶一样,重组的核糖核酸酶具有酶活性,为进一步进行啮齿类动物核糖核酸酶的宿主防卫功能研究打下了基础。     

Eglin C与2709碱性蛋白酶相互作用分析及亲和纯化方法

Eglin C是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。然而,利用eglin C纯化蛋白酶,尚未见研究报道。本文将化学合成的编码 eglin C及其突变体的基因序列,克隆到原核表达载体pQE30,在大肠杆菌BL21获得His6-Tag-eglin C及其突变体的重组蛋白质。SDS-PAGE显示,eglin C蛋白的分子量大约8 kD。His6-Tag-eglin C对胰凝乳蛋白酶、地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶的半抑制剂浓度（IC50）分别为0.20±0.15、0.24±0.19、3.33±0.47和52.46±0.38 μmol/L。利用分子对接、基因突变以及荧光光谱等,分析eglin C及其突变体与2709蛋白酶的相互作用。结果显示,2709碱性蛋白酶对eglin C荧光淬灭属于静态淬灭,解离常数为2.60×10-7 mol/L,eglin C中的Asn50 残基对eglin C和2709碱性蛋白酶的结合发挥重要作用。利用eglin C与蛋白酶的特异结合的特性,构建亲和纯化载体,用于纯化来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶,相比常规的蛋白酶纯化,显著简化了操作步骤。     

肽酰精氨酸的翻译后修饰

肽酰精氨酸残基甲基化作用是细胞质与细胞核内蛋白质翻译后修饰的普遍方式。精氨酸残基甲基化蛋白质与许多细胞生物学过程有关,包括转录调节、RNA代谢和DNA损伤修复等。生物体内精氨酸N-甲基转移酶类、肽酰精氨酸脱亚氨酶类与JMJD6等催化肽酰精氨酸残基进行甲基化、瓜氨酸化和去甲基化的动态修饰。这种动态修饰对细胞生物学功能有重要调节作用。     

一新中温碱性蛋白酶基因的克隆及原核表达

摘要:【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株,寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株,经生理生化方法及16S rDNA 基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后,利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌( Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基,编码382个氨基酸,氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基构成的前导肽,C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员,并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时,在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力,其反应最适条件为温度70℃,pH9－10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0－ 10.0)、中高温(25℃－60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。     

GL—7ACA酰化酶（C130）β亚基N端氨基酸残基的突变及功能

戊二酰 7 氨基头孢烷酸酰化酶 (即GL 7ACA酰化酶 ,EC .3.5 .1.11)的催化中心通常在 β亚基N端的第一个氨基酸 ,底物亲和标记的研究亦显示N端存在着结合靶点 ,因而该区域的结构可能与酶的功能密切相关。对C130 β亚基N端的 2～ 8位氨基酸残基分别进行了肽段置换和定点突变研究。将N端前 8位肽段置换为来源于Arthrobacterviscosus的青霉素G酰化酶 (PAC)的对应序列后 ,C130酰化酶活力丧失 ;而置换为来源于E .coli的青霉素G酰化酶 (PGA)的对应序列后 ,酰化酶活力仍然保留 ,但Km 值从 0 .44× 10 -3 mol·L-1增大为 0 .5 5× 10 -3mol·L-1,kcat值由 4.92s-1降低为 1.6 4s-1。另对C130 β亚基N端 2～ 4位氨基酸残基作了单点突变 :第 4位的Trp为可能的底物类似物结合位点 ,被变为Tyr后 ,它对底物GL 7ACA的结合能力略为减弱 ,kcat则降低为 2 .2 9s-1;而变为Leu后 ,Km 为 0 .34× 10 -3 mol·L-1,kcat为 3.15s-1;第 3位的Ser变为Met、Ala及Cys后 ,随着Km值逐渐降低 ,kcat也有所降低 ,而S3 M、S3 A突变体的kcat/Km 值比野生型的分别增加了 2 2 .3%和 39.3% ;将活性中心Ser(β1)邻位的Asn(β2 )变为Gln后 ,C130酶活大幅度下降 ,kcat减为 0 .47s-1。上述结果表明 ,C130 β亚基N端的前几个氨基酸残基均可对酶的功能