盐生杜氏藻(Dunaliella salina)cDNA文库构建及功能基因筛选

采用Qiagen公司的植物总RNA提取技术、Clontech公司的CreatorTM技术平台以及SMARTTM技术进行cDNA文库构建.从杜氏藻中提取出了高质量的总RNA,通过PowerScript反转录酶反转录杜氏藻的总RNA,采用LD-PCR、酶处理等方法对cDNA进行等比例扩增、纯化,同时使用CHROMA SPIN-400柱子将cDNA分段化,最后将长片段连入pDNR-LIB质粒,1.5 kV,25 μ F电转化大肠杆菌JM109,得到含1.5×106个克隆子的原始文库,滴度为1.5×106cfu ml-1.结合酶切和PCR,对该文库的质量进行了鉴定和统计,文库的平均片段插入长度为1.5kb.采用烯醇酶和UDP葡萄糖脱氢酶的EST作为同源探针,对文库中的功能基因进行筛选,并采用放射性原位杂交法,对扩增文库进行了初筛和复筛,得到了含这两条基因全编码序列的cDNA,烯醇酶为1.8kb,UDP葡萄糖脱氢酶为1.9kb,为今后对该种进行大规模功能基因组学研究奠定基础.     

利用RNAi技术大规模分析基因功能的研究

将双链RNA导入细胞内会干扰与之同源的基因的表达 ,使生物体产生相应的功能缺陷表型 ,这种作用称为RNAi(RNAinterference)。针对人类、植物、微生物等大规模基因组测序后所面临的功能鉴定难题 ,着重探讨了RNAi的机制及其研究进展。复合物RISC和酶Dicer的发现揭示了RNAi导致同源基因沉默的作用机理。通过使用RNAi这种反向遗传学工具可使生物体产生相应的功能缺陷表型 ,从而确定未知基因的功能。因此RNAi对大规模分析动、植物基因功能的研究具有重要的作用。     

杜氏藻属四个种的核型分析

采用染色体分带方法对杜氏藻属（Dun>0.25aliella）4个种的核型进行分析。经过25℃12hd（-1）的光周期诱导,杜氏藻属4个种出现同步化生长。用0.05％秋水仙素处理,再经低渗、固定和高位（60cm）滴片,获得杜氏藻属4个种的核型。结果表明:杜氏藻属4个种都是单倍体,其染色体大多为短杆状、极小。染色体数分别是:D.salina n=13,D primolecta n=20,D.bardawil n=10,D.parvan=16。它们大都可见较明显的初级缢痕,且都在染色体的中部。     

中国特有诸葛菜复合群的系统发育关系

利用5．8S核糖体DNA全长间隔序列（ITS／5．8S）和叶绿体基因mat K对中国原产诸葛菜复合群的系统发育关系进行了分析研究。ITS序列结果支持中国诸葛菜复合群分为两支：一支由湖北诸葛菜和太白诸葛菜组成;另一支由诸葛菜和铺散诸葛菜组成。mat K的序列分析结果表明,在中国诸葛菜复合群的系统发育树中,铺散诸葛菜和诸葛菜处于基部位置。结合以前的核型分析和本文的研究结果,我们不支持将湖北诸葛菜和太白诸葛菜归隶于诸葛菜,而支持我们之前提出的两种可能的原始细胞型的进化假说。另外,根据生物地理学分析,推测从长江中下游到秦岭地区是中国原产诸葛菜的近代分化中心。     

一新中温碱性蛋白酶基因的克隆及原核表达

摘要:【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株,寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株,经生理生化方法及16S rDNA 基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后,利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌( Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基,编码382个氨基酸,氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基构成的前导肽,C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员,并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时,在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力,其反应最适条件为温度70℃,pH9－10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0－ 10.0)、中高温(25℃－60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。     

利用RAPD分析杜氏藻属（Dunaliella）嗜盐种间遗传多样性

本研究首次运用随机引物对杜氏藻属（Dunaliella）中6个嗜盐种的基因组DNA进行RAPD分析。筛选获得的6个有效引物共扩增出98个可重复的DNA片段,其中95条带具有多态性,多态性条带的频率为96．9％。根据系统进化树图将杜氏藻属6个种分别归于亲缘关系相对较远的2个类群中,且6个种与它们各自的生态分布联系不紧密。