经过改造的酶可以提高油和脂的质量

美国Genencor公司的蛋白质工程专家最近改进了一种酶,这种改进了的酶可以把廉价的植物油转变为优质产品。例如,某种稳定有效的酶可以把便宜的棕榈油转变成贵重的可可脂。通过改变组成甘油三酯的脂肪酸的比例类型而制造的产品可以取代其它许多高价的植物油和动物脂。 Genencor的研究人员正在研究的是枯草杆菌蛋白酶,这是人们所熟悉的一种用于洗涤剂中清除蛋白污渍的酶。早些时候,Genencor曾通过置换该酶分子链上一或两个关键位置的一个氨基酸而改进了它的功能。此外,枯草杆菌蛋白酶属于丝氨酸水解酶,这类酶中有一     

枯草杆菌蛋白酶的基因工程改性

枯草杆菌蛋白酶（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）是一种工业上应用很广的酶,在洗涤剂、制革、丝绸等多种行业上有着广泛的用途。特别是用于生产加酶洗涤剂,帮助去除血渍、奶渍、汗渍及可可等各种蛋白污垢。１９６０年,丹麦人首先利用地衣芽孢杆菌生产了被称为Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ的碱性蛋白酶,随后该酶被用于生产加酶洗涤剂,目前有资料称国外市场上９０％是加酶洗涤剂。国内１９９０年枯草杆菌蛋白酶产量约为１．３万吨,加酶洗衣粉占洗涤剂总量约１０％。枯草杆菌蛋白酶的生产菌和研究对象主要是地衣芽孢杆菌、解淀粉芽…     

嗜热脂肪芽孢杆菌中耐热蛋白酶基因的克隆

用鸟枪法把嗜热脂肪芽孢杆菌313一l(供体菌)染色体上的蛋白酶基因克隆到质粒pPL603上,并在枯草杆菌中得到表达。此基因位于6．6kb的EcoRI酶切片段上,带有重组质粒的枯草杆菌所产生的蛋白酶活性比供体菌株约提高30倍左右。该酶的最适反应温度为75℃,最适pH为7．0左右,是一个中性蛋白酶,在80℃作用30min后仍保留85％以上的酶活。     

枯草杆菌碱性蛋白酶Ki 2基因的序列测定及M222A定点突变

含有枯草杆菌碱性蛋白酶Ｋｉ-２基因的１.９ｋｂＤＮＡ片段用限制酶切成几个小片段,将这些片段分别插入Ｍ１３ｍｐ１８或Ｍ１３ｍｐ１９中,用通用测序引物测得全序列。所得全序列与蛋白酶Ｅ相比较,在结构基因部分仅有８个碱基不同,由此而导致两个氨基酸的差异。此１.９ｋｂ的片段插入枯草杆菌大肠杆菌穿梭质粒Ｐｂｅ-２,得到的重组质粒转化蛋白酶缺陷型的枯草芽孢杆菌ＤＢ１０４,结果表明枯草杆菌碱性蛋白酶Ｋｉ-２基因在ＤＢ１０４中能利用自身的调控元件表达并分泌到胞外。将Ｋｉ-２蛋白酶的２２２位甲硫氨酸突变成丙氨酸,突变后的Ｋｉ-２蛋白酶具有抗氧化性,但比活性比野生型的约低１倍     

枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

蛋白酶是枯草杆菌(Bacillus subtilis)产生的具有重要工业价值的水解酶。对蛋白酶基因的分离与高效率表达一直是基因工程研究领域的重要内容之一^[1-4]。蛋白酶基因的筛选可采用不同的方法,如“免疫法”、“DNA 杂交法”、“遗传互补法”等。大肠杆菌(Escherichia coli)是基因工程中最常用的宿主菌, 若能以E．Coli作为筛选蛋白酶基因的宿主苗,那么使用E．Coli的常规载体,便可直接获得完整的蛋白 酶基因。枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达．则是实现这一目标的关键。Koide等人^[5]报道过枯草杆菌的胞内丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。转化细胞在含有脱脂牛奶的平板上可产生十分微弱的水解圈。Ikeraara等人^[6]将Subtilisin E(枯草杆菌蛋白酶E)插人大肠杆菌的表达载体,具有活性的Subtilisin E便可分泌到大肠杆菌的细胞周质中。吴汝平撰文指出^[7]。克隆的枯草杆菌蛋白酶基因不能在大肠杆菌中表达。是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。Wang等人^[8]则认为,在大肠杆菌中观察不到野生型的中性蛋白酶基因E(nprE)的表达。是因为nprE的表达产物对大肠杆菌有致死作用．除去该基因上的核糖体结合位点,nprE便能在大肠杆菌中低水平表达,并能将表达产 物分泌至胞外。由上可知．枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达以及表达的位置仍然是一个众说纷纭的问题,这一问题也正是能否用大肠杆菌作为宿主菌筛选蛋白酶基因的关键。     

核糖核酸酶A的s-蛋白与DNA的结合作用

核糖核酸酶A具有DNA结合蛋白的作用。本文报道,核糖核酸酶A经枯草杆菌蛋白酶作用后,被切断而形成一个20肽和s-蛋白。分离纯化后的s-蛋白完全丧失了水解RNA的酶活性,却完全保持着作为DNA结合蛋白的活性。这个结果说明核糖核酸酶A表现RNA水解酶活力与其同DNA的结合作用对结构的要求有所不同。对s-蛋白与双链及单链DNA结合作用的研究还表明,在这种结合过程中s-蛋白分子中的酪氨酸和苯丙氨酸残基的萤光发生淬灭作用,可能系因s-蛋白中的这些氨基酸残基直接参与了与DNA的结合,RNaseA经枯草杆菌蛋白酶作用切除s-肽后产生的s-蛋白的α-螺旋含量由RNaseA的17.5%增加到23.7%。     

核糖核酸酶A的s-蛋白与DNA的结合作用

核糖核酸酶A具有DNA结合蛋白的作用。本文报道,核糖核酸酶A经枯草杆菌蛋白酶作用后,被切断而形成一个20肽和s-蛋白。分离纯化后的s-蛋白完全丧失了水解RNA的酶活性,却完全保持着作为DNA结合蛋白的活性。这个结果说明核糖核酸酶A表现RNA水解酶活力与其同DNA的结合作用对结构的要求有所不同。对s-蛋白与双链及单链DNA结合作用的研究还表明,在这种结合过程中s-蛋白分子中的酪氨酸和苯丙氨酸残基的萤光发生淬灭作用,可能系因s-蛋白中的这些氨基酸残基直接参与了与DNA的结合,RNaseA经枯草杆菌蛋白酶作用切除s-肽后产生的s-蛋白的α-螺旋含量由RNaseA的17.5%增加到23.7%。     

枯草杆菌蛋白酶E的156和165位突变

应用定点突变方法,在M222A突变的枯草杆菌蛋白酶E基因上进行E156S和V165I定点突变. 将突变基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pBE-2中,在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DB104中进行表达,得到突变种(M222A,E156S)和(M222A,E156S,V165I)蛋白酶E. 性质测定表明,E156S突变使蛋白酶比活力增加90%,并不影响酶的热稳定性和抗氧化性. 而V165I突变使蛋白酶比活力降低.     

酶促反应的“诱导契合-锁钥”模式

在酶学理论中,阐释酶识别底物专一性的代表性学说有"锁钥"和"诱导契合"模型等.作者此前研究了蚯蚓蛋白酶Ⅰ(Eisenia fetida proteaseⅠ,EfP-Ⅰ)的底物专一性,提出了"诱导契合-锁钥"反应模式.然而,采用EfP-Ⅰ建立的模式是否具有普遍的酶学意义需要进一步论证.以蚯蚓蛋白酶Ⅱ(Eisenia fetida proteaseⅡ,EfP-Ⅱ)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin,Sub)以及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为材料,分别研究了底物反应后酶与其他底物的相互作用.结果显示,经过凝血酶底物chromozym TH(CTH)反应后,蚯蚓蛋白酶Ⅱ和枯草杆菌蛋白酶与尿激酶底物(chromozym U,CU)的反应活性显著降低(P<0.05),表现出符合"诱导契合-锁钥"反应的模式.蚯蚓蛋白酶Ⅱ和枯草杆菌蛋白酶先与CU反应后,却仍能与CTH反应,但后续不能与CU发生反应,仍然表现为"诱导契合-锁钥"模式.另外,丙酮酸反应后的LDH,对乳酸的反应活力显著降低(P<0.05),而乳酸反应后的LDH对丙酮酸的活性却无显著变化.这可能是丙酮酸诱导的LDH构象具有相对的刚性,而乳酸诱导的酶构象具有相对柔性所致.     

鲮鱼皮胶原肽的制备及其抗氧化活性的检测

为了以细菌胞外蛋白酶酶解低值蛋白资源制备抗氧化活性肽以及挖掘新型蛋白酶,采用液体发酵培养的方法对假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.SHK1-2进行发酵产酶,获得胞外蛋白酶粗酶液用于酶解热水法提取的鲮鱼胶原蛋白,通过超滤、sephadex LH-20分子筛层析获得具有DPPH自由基清除能力(35.6%±7%)、氧自由基清除能力(Oxygen radical absorbance capacity,ORAC)及DNA氧化损伤抑制活性的小分子肽,液相色谱质谱联用鉴定该活性肽分子量为776.2 Da,预测氨基酸序列为Thr-Ala-Gly-His-Pro-Gly-Thr-His。ORAC检测验证了人工合成的多肽同样具有抗氧化活性。研究表明细菌胞外蛋白酶在低值资源高值化中具有一定的应用前景,对于新型蛋白酶及其应用的挖掘具有一定的参考意义。     

萌发绿豆中水解大豆胰蛋白酶抑制子蛋白酶的纯化及固定化

大豆是豆类植物中最早发现存在蛋白酶抑制子的 ,由于其存在影响了豆类的利用价值 ,因此研究人员一直在寻找着解决办法。采用加热处理方法不能彻底钝化豆类蛋白的蛋白酶抑制子活性 ,且豆类蛋白的含硫氨基酸主要存在于各类蛋白酶抑制子中 ,从豆类蛋白中除去抑制子蛋白将大大降低其营养效价。本研究的目的是试图寻找一种可在常温下降解豆类胰蛋白酶抑制子的蛋白酶 ,从而钝化豆类的胰蛋白酶抑制活性。在前期工作中 ,我们发现枯草杆菌蛋白酶 (Ｓｕｂ ｔｉｌｉｓｉｎ)可在在常温下降解花生及大豆胰蛋白酶抑制剂[1] ,近期我们的研究表明 ,Ａｌｃａ…     

枯草杆菌AS 1.398蛋白酶制剂中的几种酶系

枯草杆菌AS 1.398菌株是产生中性蛋白酶的生产菌株。但由于目前的酶制剂是多种酶的混合物,所以应用范围受到很大限制。为了更好地发挥该酶制剂的应用潜力,我们对其中的几种酶系进行了研究。     

供洗涤剂用的碱性蛋白酶

日本东洋曹达工业公司已明确可供应洗涤剂用酶碱性蛋白酶样品。大阪市立大学皆用基教授于1987年6月6日在京都召开的纤维制品消费科学会议上报告说,洗涤剂中配有蛋白和脂肪酶这两种酶能提高洗涤剂的洗净效果。其中就有东洋曹达的碱性蛋白酶产品“Toyozyme NP”。 “Toyozyme NP”是纯度很高的粗酶,活性约60万单位/克,比昭和电工公司的蛋白酶“API-21”约高6倍。     

猪皮胶原蛋白水解产物中的抗氧化活性肽的分离及其氨基酸组分

利用不同蛋白酶水解猪皮胶原蛋白,根据水解产物对自由基的清除率,筛选最适蛋白酶的组合,筛选抗氧化活性较高的肽类,并进行氨基酸分析.结果表明:胃蛋白酶→木瓜蛋白酶→菠萝蛋白酶为酶解胶原蛋白的最佳组合;分离纯化得到了三种具有较高抗氧化活性的肽;氨基酸组分分析显示:P1′、P2′和P3′组分具有自由基清除作用的关键氨基酸甲硫氨酸、酪氨酸和组氨酸等.     

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。【方法】利用硫酸铵盐析,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化,SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量,采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2,分子质量分别约为37 kD和45 kD。以酪蛋白为底物时,P1的Km=8.36 g/L,Vm=12.95μg/(mL·min),最适反应条件为pH 8.0、45°C;P2的Km=4.11 g/L,Vm=4.86μg/(mL·min),最适反应条件为pH 7.0、45°C。两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低。P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。【结论】两种蛋白酶的酶学性质存在差异;两者对疏水氨基酸构成的肽键具有选择性,但其作用基团存在特异性。这些研究结果将为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。     

酱油曲霉蛋白酶活力的提高

蛋白酶在工业上被广泛地应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品和酿造等行业。霉菌生产的蛋白酶在豆酱和酱油生产上的应用已经具有相当悠悠的历史。曲霉菌,例如米曲霉、黄曲霉、栖土曲霉等,一般能分泌2～3种蛋白酶(酸性、中性及碱性),其中以中性和碱性酶为主。黑曲酶则以产酸性蛋白酶为主。酱油曲霉所产的蛋白酶也以中性     

蚯蚓外源酶与内源酶酶解产物分析

本试验采用了枯草杆菌(Bacillus subtilis)AS1.398枯草杆菌蛋白酶和自溶制备蚯蚓肽,通过前期单因素试验,设计正交试验L9(34),以氨基氮数,多肽浓度为衡量指标,对最佳酶解条件进行筛选研究,并分析了酶解液氨基酸组成和相对分子量的分布。结果表明:AS1.398枯草杆菌蛋白酶最佳酶解条为pH 6.5、酶浓度1%、温度50℃、反应时间8 h,在此条件下,酶解蚯蚓蛋白的每100 mL水解液氨基氮数可以达到16.55 mmol,多肽浓度达9.22 mg/mL;自溶酶解蚯蚓的最佳条件pH 7.0、底物浓度1∶2、温度50℃、反应时间6 h,在此条件下,酶解蚯蚓蛋白的每100 mL水解液氨基氮数可以达到21.55 mmol,多肽浓度达11.65 mg/mL;二者酶解产物分子量大部分是在5000以下的多肽、小肽及氨基酸的混合物,其中分子量在300以下占了80%,氨基酸组成平衡,含量丰富,可用来制取新型氨基酸微量元素及小肽添加剂。通过控制酶解条件,蚯蚓可以利用自身的酶源自溶来代替外源酶,从而降低成本。     

植物根际芽胞杆菌菌种资源采集及其具有过水解催化活性水解酶基因的克隆

[背景]芽胞杆菌源枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)和头孢菌素乙酰水解酶(cephalosporin acetyl hydrolase)具有较高的过水解催化活性,有商业开发价值。[目的]挖掘芽胞杆菌菌株中具有过水解酶催化活性的水解酶蛋白基因,为后续制备过水解酶及酶法合成过氧乙酸奠定基础。[方法]利用定向筛选培养基,从植物根际及纳豆产品中筛选产蛋白酶芽胞杆菌候选菌株,并利用RFLP及16S rRNA基因对其进行鉴定。从蛋白酶高产芽胞杆菌菌株中克隆枯草杆菌蛋白酶、乙酰木聚糖醋酶和头孢菌素乙酰水解酶的全长基因。[结果]从植物根际土壤及纳豆产品中共分离到85个候选菌株,RFLP及16S rRNA基因鉴定结果表明候选菌株均为芽胞杆菌,分别属于Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus pumilus和Bacillus megaterium四个类群。从B.subtilis NSYT-3克隆的枯草杆菌蛋白酶基因编码的多肽链全长381个氨基酸,从B.pumilus OSLJ-3克隆得到的乙酰基木聚糖酯酶基因编码的多肽链全长320个氨基酸,从B.subtilis NSYT-3克隆的头孢菌素乙酰水解酶基因编码的多肽链全长318个氨基酸,3D结构模拟表明这3个酶蛋白均具有α/β水解酶折叠家族蛋白结构特点。[结论]芽胞杆菌源具过水解催化活性水解酶基因的克隆,为后续开发酶法合成过氧乙酸工艺奠定了基础。     

嗜酸乳杆菌产生的广谱抗菌肽AP311的分离和鉴定

分离、鉴定了乳酸菌素片生产菌嗜酸乳杆菌 (Lactobacillusacidophilus)产生的热稳定性抗菌多肽AP31 1。浓缩的AP31 1对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。AP31 1对枯草杆菌蛋白酶、凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K敏感。AP31 1的抑菌活性随pH升高而降低 ,在酸性pH(pH2～ 4)条件下可经 1 0 0℃加热 30min活性不变。正丁醇可使AP31 1沉淀 ,当沉淀溶解于pH2的酸溶液时 ,活性恢复。氯仿、甲苯、乙酸乙酯、丁酮等有机溶剂对AP31 1活性没有影响。基于AP31 1可被蛋白酶酶解 ,具有广谱的抑菌活性 ,认为这种生物活性物质是一种抗菌肽。     

枯草杆菌产弹性酶及提纯工艺研究

对枯草杆菌产酶弹性蛋白酶和酶提纯生产工艺进行了系统研究,得到了含弹性蛋白酶活力为3万u/g的纯酶粉。