人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。     

人Polo样激酶1活性缺失突变体和结构域在293细胞中的瞬时表达

目的:构建人Polo样激酶1(Plk1)活性缺失突变体及结构域突变体的真核表达载体,并在293细胞中表达。方法:用二次PCR方法扩增Plk1基因并点突变,将82位赖氨酸突变为精氨酸,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;用普通PCR方法扩增Plk1激酶区域及Polo盒区域(PBD)基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中;将上述质粒转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达。结果:构建了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD真核表达质粒,在293细胞中均可有效表达,蛋白相对分子质量分别为68×103、45×103、31×103。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1(K82R)、Flag-Plk1KD、Flag-Plk1PBD蛋白,有助于进一步探究Plk1对底物的功能。     

CARP1基因克隆、表达及其泛素连接酶活性的鉴定

目的：克隆并表达caspase-8／10相关RING结构域蛋白1（CARP1）基因,检测其泛素连接酶活性。方法：提取结肠癌HCT116细胞总RNA,RT-PCR扩增CARP1基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中,序列正确的阳性克隆进行扩增,提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达,通过体内泛素化检测其泛素化酶活性,通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响,利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果：免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达;免疫共沉淀实验表明,当CARP1存在时,受体相互作用蛋白1（RIP1）被泛素化;萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a（TNFa）引起的NF-kB报道基因的激活;通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长,并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论：构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达,表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性,可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活,并且促进结肠癌细胞的生长,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

雌激素受体β潜在磷酸化位点突变体的构建及其活性测定

目的：构建雌激素受体（ER）β潜在磷酸化位点突变体,并在人胚肾细胞293T中检测其对ERβ下游基因转录的影响。方法：通过ERα和ERβ序列同源性比对,寻找ERβ的潜在磷酸化位点;以pcDNA3-ERβ-FLAG为模板,通过重组PCR,将ERβ264位、469位Ser编码基因突变为Ala编码基因,将突变片段连接到同样双酶切的pcDNA3-FLAG载体中,Western blot检测其表达;将重组质粒转入293T细胞中,检测突变体对含雌激素应答元件（ERE）的报告基因转录活性的影响。结果：ERα和ERβ序列同源性比对发现ERβ的264位Ser和469位Ser可能是其潜在的磷酸化位点;构建了ERβ264位和469位2个点突变体载体pcDNA3-FLAG-ERβ（S264A）和pcDNA3-FLAG-ERβ（S469A）,Western blot可检测到ERβ突变体融合蛋白在293T细胞中表达。萤光素酶活性检测表明,在没有雌激素刺激的情况下,2个突变体的活性较野生型没有变化;加入雌激素后,突变体的活性较野生型略有升高。结论：ERβ的264位和469位Ser位点的磷酸化可能不是ERβ调节下游基因转录所必需的,活性升高可能是由于ERβ构象变化造成的。     

组蛋白去乙酰化酶HDAC2突变体构建及其SUMO修饰E3连接酶功能研究

目的:针对人源HDAC2外显子拼接功能区(CDS)基因,运用双管法突变体构建技术,构建HDAC2去乙酰化酶功能失活的片段缺失与关键位点突变体,检测突变体的SUMO化修饰E3连接酶功能活性,探究此HDAC2新功能是否受到其固有的去乙酰化酶功能的影响.方法:设计HDAC2 100-322位氨基酸密码子缺失的片段突变体引物与142位H→A点突变体引物,利用HDAC2的pcDNA3.1真核表达质粒为模板,通过耐热Fusion酶PCR反应双管扩增相应的单链DNA,并经退火、模板酶切、乙醇纯化、感受态转化、抗性平板筛选、测序鉴定获得两种HDAC2去乙酰化酶功能失活的pcDNA3.1真核表达质粒.免疫印迹检测突变体质粒在细胞中的表达,荧光素酶(LUC)报告基因实验检测其SUMO化修饰E3连接酶功能活性.结果:成功构建HDAC2去乙酰化功能失活的片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2 (DEL 100-322AA)与关键位点突变体pcDNA3.1/HDAC2(142 H→A).C-myc标签的免疫印迹检测显示两种突变体在细胞中可稳定表达.将突变体转染进入三种细胞,LUC报告基因分析结果显示突变体仍具有E3连接酶功能活性.结论:HDAC2的E3连接酶功能不依赖于其去乙酰化酶活性,并且E3连接酶功能结构域位于其序列C端.     

IκBα缺失突变体真核表达载体的构建、表达及其生物活性检测

旨在构建缺失N端前36个氨基酸的IκBα突变体真核表达载体,并对其表达及生物学活性进行检测.从人源子宫颈癌细胞HeLa中提取总RNA,利用RT-PCR的方法获得IκBα缺失突变体的cDNA,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中,构建重组载体pcDNA3.1-IκBαΔN.通过PCR方法、NcoⅠ酶切以及核酸测序分析对其进行鉴定;采用Western Blot检测IκBα缺失突变体蛋白在HeLa细胞中的表达.将pcDNA3.1-IκBαΔN和pNF-κB-Luc共转染 HeLa细胞,经TNF-α诱导后,利用萤光素酶报告系统来检测重组载体对NF-αB的抑制活性.结果表明,经PCR方法、NcoⅠ酶切鉴定及核酸测序分析后,证实成功构建了重组载体pcDNA3.1-IκBαΔN;IκBα缺失突变体蛋白在HeLa细胞中高效表达,并对NF-κB有显著的抑制活性(P＜0.01).因此,真核表达载体pcDNA3.1-IκBαΔN构建成功,为一步研究NF-κB信号传导通路及其相关疾病提供有效的分子工具.     

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。     

c-Myb截短突变体的构建及其对c-Myc蛋白表达的调节

目的:为了研究c-Myb蛋白各结构域的功能,构建c-Myb的6种截短突变体c-Myb-1~c-Myb-6的真核表达载体,测定不同突变体对c-Myc蛋白表达的影响。方法:以野生型c-Myb为模板,PCR扩增c-Myb-1~c-Myb-6片段,分别克隆到pcDNA3.0-FLAG载体,Western印迹检测克隆载体在293T细胞内的表达;将上述载体与野生型c-Myb转染乳腺癌细胞株MCF-7,检测其对c-Myb下游基因c-Myc表达的影响。结果:构建了c-Myb-1~c-Myb-6表达载体,与野生型c-Myb相比,c-Myb-1、c-Myb-4、c-Myb-5均能够促进MCF-7细胞中c-Myc的表达,而c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-6则不能。结论:该研究为进一步探讨c-Myb在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

人TBK1小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰TBK1细胞株的筛选

目的:构建人TANK结合激酶1(TBK1)的小干扰RNA真核表达质粒,并筛选出稳定干扰TBK1的细胞株。方法:根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对TBK1的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后得到质粒psiTBK1。用脂质体转染质粒psiTBK1到MCF-7细胞中,经G418加压筛选稳定表达TBK1小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹检测细胞中TBK1的表达情况,将干扰效果好的细胞株命名为MCF-7/siTBK1,再用萤光素酶试验检测MCF-7/siTBK1细胞对外源TBK1诱导干扰素-β(IFN-β)转录的情况。结果:免疫印迹结果证实建立的稳定细胞株MCF-7/siTBK1能够有效干扰TBK1的表达,并在外源TBK1存在的情况下抑制IFN-β的转录活性。结论:构建了表达TBK1小干扰RNA的质粒psiTBK1,筛选出稳定干扰TBK1表达的细胞株MCF-7/siTBK1,为深入研究TBK1在先天免疫中的作用提供了平台。     

ABCA1中间缺失突变体的构建及其抗砷性研究

目的:构建缺失ABCA1,ABCA1蛋白胞外第一环第264-520位氨基酸密码子的基因,并真核表达检测其抗砷性变化.方法:应用重叠区扩增基因拼接法的原理,在拼接延伸后,再进行一次PCR扩增,得到缺失第264-520位氨基酸密码子的ABCA1基因,克隆至pcDNA3.1/V5-His真核表达载体.通过激光共聚焦检测突变体细胞定位,MTT加砷后检测突变体生存率变化.结果:成功构建缺失ABCA1蛋白胞外第一环第264-520位氨基酸密码子的基因.共聚焦显微镜观察突变体定位于细胞膜上,随机区组方差分析结果显示ABCA1突变体生存率明显低于ABCA1野生型.结论:ABCA1胞外第一环缺失突变后基本丧失抗砷功能.     

布鲁氏菌2308ery基因启动子缺失株的构建及鉴定

目的:构建布鲁氏菌2308株ery基因启动子缺失株。方法:用PCR方法从亲本株2308上扩增ery基因启动子侧翼序列,将该片段与pMD19-T连接,亚克隆为自杀载体pGEM-7zf-Δery-sacB。将自杀载体电转化布鲁氏菌感受态细胞中经同源重组后,分别用100 mg/L氨苄和7%蔗糖筛选。对获得的基因缺失株进行RT-PCR鉴定和遗传稳定性检测。结果:成功获得ery基因启动子缺失株,2308Δery基因启动子缺失株未扩增出eryA基因。并且该缺失株在10代以内未发生回复突变。结论:成功构建2308Δery基因启动子缺失株,为研究布鲁氏菌的毒力基因及其流产机制奠定基础。     

tPA突变体在哺乳动物细胞中的表达

利用携带有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的pCI载体,实现tPA突变体(FrGGI)在CHO-dhfr^-细胞中的高效表达,获得高表达细胞株。采用分子克隆常规技术,将去除3’端非蛋白编码区的tPA突变体cDNA与pCI载体连接,构建真核表达载体pCI—tPA;采用阳离子脂质体转染法转染CHO-dhfr^-胞。经酶切及测序鉴定,证明所构建的质粒正确,转染CHO—dhfr细胞后,经过MTX加压筛选,得到了10株表达水平较高的细胞株,其活性可达每106细胞4000U／24h。以上结果为进行tPA突变体工程细胞株的筛选奠定了基础。     

利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株

目的：建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率;方法：采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果：结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论：基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK－／gG－／LacZ＋突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒pSTK1-4,进一步改造成为转移质粒pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/LacZ^ 突变株基因组DNA共转染PK－15细胞,等完全病变后,收毒作空斑试验,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化3次,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的无TK^-/LacZ^ 突变株污染的TK缺失的重组病毒,分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增,扩增产物经酶切分析和测序后发现：TK缺失重组病毒的TK基因缺失了205个碱基,XhoⅠ和SalⅠ位点消失,SmaⅠ酶切片段发生变化,两种病毒在PK－15细胞上形成空斑的大小和增殖 滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA,与含gG-LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK－15细胞,待完全病变后,在X-gal存在下筛选蓝斑,将桃取的蓝斑纯化3次后,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段,同时又能扩增出LacZ基因,证实所得到的重组病毒为TK^-/gG^-/LacZ^ 突变株。此双缺失突变株的构建成功,为在我国最终根除伪狂犬病提供了有用的工具。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxH基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化,它的突变apxⅡCA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxⅡCA基因发生同源交换,两步法筛选获得了apxⅡ基因突变株HBC^-／GFP^ ,PCR和Southern blot对突变株进行初步鉴定,进一步对突变株的一些生物学特性,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

质粒RP4CFIts突变体筛选及Kil表型分析

用羟胺体外诱变质粒RP4后再转化受体菌,我们选择到一抹温度敏感的菌落形成抑制突变体。其表型为在非允许温度时培养,不能由单个菌体繁殖为集落,类似于Kor基因失活引起的Kil表型。生化分析表明:在非允许条件下,突变体的生长逐步受到抑制,大约繁殖两代后即全面抑制,此时宿主菌的DNA、RNA、蛋白质等大分子合成几乎全部下降,但β-半乳糖苷酶的合成却并未停止,只是由于细胞通透性改变而大部分排出胞外,另外噬菌体感染后的产率也明显降低,并且在非允许温度处理20h内,此种状态是完全可逆的,即仍可因放回允许温度培养而形成集落,据此抑制现象的逐步发生性,大分子合成的全面抑制性和完全可逆性判断,很可能和宿主细胞在紧急状态下的整体调节机制——严紧型反应有关。     

构建微生物突变体的方法综述

生物学范畴内的突变是指细胞中的遗传物质发生可遗传的改变,包括DNA碱基对的置换、增添或缺失等结构的变化。人们利用突变生物体进行科学研究和培育新产品。综述了人工构建突变体的几种常用方法及原理,着重介绍了应用基因工程技术进行微生物改造的方法,为科研工作和生产实践拓展思路。     

以新霉素抗性基因突变体为筛选标志的真核表达载体的构建

新霉素抗性基因(neo)是真核表达载体的常用筛选标志neo基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ）,能催化G418、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性。通过对真核表达载体的筛选标志基因neo进行定点突变,以降低NPTⅡ的活性,然后用含neo突变体的真核表达载体pmDNA构建荧光素酶表达质粒,稳定转染CHO-K1细胞,发现表达荧光素酶的阳性细胞比例达到95%,其中高表达细胞集落的筛选率明显高于对照组。     

Construction of EMS-Induced Peanut Mutant Libraries and Identification of Pod-Related Traits Mutant Lines

Peanut (Arachis hypogaea L.) is an oil and economic crop of vital importance, and peanut pod is the key organ influencing the yield and processing quality. Hence, the Pod-related traits (PRTs) are considered as important agronomic traits in peanut breeding. To broaden the variability of PRTs in current peanut germplasms, three elite peanut cultivars were used to construct Ethyl methane sulfonate (EMS)-induced mutant libraries in this study. The optimal EMS treatment conditions for the three peanut varieties were determined. It was found that the median lethal dose (LD50) of EMS treatment varied greatly among different genotypes. Finally, the EMS-induced peanut mutant libraries were constructed and a total of 124 mutant lines for PRTs were identified and evaluated. Furthermore, “M-8070”, one of the mutant lines for pod constriction, was re-sequenced via high-throughput sequencing technology. The genome-wide variations between “M-8070” and its wild parent “Fuhua 8” (FH 8) were detected. 2994 EMS-induced single nucleotide polymorphisms (SNPs) and 1188 insertion-deletions (InDels) between “M-8070” and its wild parent were identified. The predominant SNP mutation type was C/G to T/A transitions, while the predominant InDel mutation type was “1-bp”. We analyzed the distribution of identified mutations and annotated their functions. Most of the mutations (91.68% of the SNPs and 77.69% of the InDels) were located in the intergenic region. 72 SNPs were identified in the exonic region, leading to 27 synonymous, 43 non-synonymous and 2 stop-gain variation for gene structure. 13 Indels were identified in the exonic region, leading to 4 frame-shift, 8 non-frame-shift and 1 stop-gain variations of genes. These mutations may lead to the phenotypic variation of “M-8070”. Our study provided valuable resources for peanut improvement and functional genomic research.