血红素亲和层析快速纯化香椿子抗氧化活性蛋白

以蛋白质含量、总还原力和DPPH清除能力为指标,对盐析法、碱提酸沉法、直接加热法进行评价,选取蛋白含量高同时有较强还原力的碱提酸沉提取法。将环氧氯丙烷活化血红素偶联于Sephadex G-25制作亲和层析柱,以水为平衡液、Na Ac-HAc缓冲液为洗脱液进行香椿子蛋白纯化,考马斯亮蓝法测定所得蛋白纯度,并对其进行初步抗氧化研究。结果表明:目标产物蛋白具有较好的DPPH清除能力,含量由59.51%提高至96.23%,纯化后蛋白纯度得到显著提高(P0.05)。     

用于DNA或RNA去盐、去蛋白及浓缩的一种方便的新方法

一种新型方便的层析柱,NENSORB~(TM)20核酸纯化柱,已被发展起来,用于从DNA和RNA中除去蛋白、盐、非掺入的放射性核苷酸以及其它低分子量物质。NENSORB20柱的使用免去了酚/氯仿抽提及乙醇沉淀这样一些典型的低得率步骤,也可用于浓缩稀释的核酸溶液。NENSORB20柱已被用来(1)从缺口转译反应混合液中纯化标记的DNA;(2)从SP6RNA聚合酶反应液中纯化标记的RNA探针;(3)纯化有末端~(35)S或~(32)P标记的DNA或RNA;(4)纯化通过M13模板上的引物延伸反应制备出的单链DNA探针;及(5)从限制性酶消化液中纯化DNA片段。 与传统的阴离子交换方法不同,这里洗脱核酸的溶液不需含有盐。DNA和RNA收集在酒精/水溶液中;彻底干燥后,核酸可直接用于进一步的生化反应。在缺口转译、末端标记、克隆、杂交、SP6聚合酶反应、蛋白质反应以及其后的实验中,经NENSORB20柱纯化的DNA或RNA样品都显示出极好的生物学活性。从含有lng到20μg核酸和蛋白的体外反应液中可得到优质、量可重复的收集物(通常60～90％)。     

Shotgun法测序制备高纯度水稻基因组DNA的方法探讨(英)

在用散弹 (shotgun)法测定水稻 (OryzasativaL .ssp .indica)基因组全序列的过程中 ,叶绿体和线粒体DNA的污染问题非常严峻 .应用脉冲场电泳 (PFGE)技术对水稻基因组DNA进行纯化 ,结果表明它能够有效去除叶绿体和线粒体DNA ,使其污染率从 3%降低到 0 2 % .同时 ,比较了水稻绿苗和黄化苗的DNA得率 ,以及HB法和NIB法制备大分子质量(HMW)DNA的异同 .最后提出一套制备水稻基因组DNA的方法 ,包括黄化苗培养 ;细胞核的分离、包埋和裂解 ;脉冲场电泳纯化、回收聚集在低熔点 (LMP)胶中的水稻HMWDNA .用该方法所得的水稻基因组DNA ,纯度高 (无叶绿体和线粒体DNA污染 )、基因组完整 (机械剪切和降解少 )、回收率高 (操作过程中DNA损失少 ) .另外 ,首次报道在融化的低熔点(LMP)胶中对水稻HMWDNA于 38℃进行超声波处理 ,能够获得用于shotgun文库和梯度文库构建所需要的各种DNA片段(1 5～ 3kb ,3～ 12kb) ,并且效果优于在TE中进行操作     

安徽小檗生物碱成分的研究

安徽小檗(Berberis anhweiensis Ahrendt)的酸水提取部分进行硅胶柱色谱分离纯化,并通过波谱学方法,鉴定出6个原小檗碱型生物碱,分别为小檗碱(1)、巴马汀(2)、dehydroeapaurinine(3)、药根碱(4)、非洲防己碱(5)和jatrorubine(6).这6种生物碱均为首次从安徽小檗中分得.其中巴马汀的含量比大多数小檗科其他植物高.     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

931129由各种方法纯化的质粒ONA的Taq循环翻序〔英〕/Hradetzky,D.…1 Bioteeh Forum Eur一1092,9(7~8)一471~472〔译自DBA,1992,11(20),92一11144) DNA模板的纯化是测序中最关键最困难的一步。就DNA得率、花费、碱基范围和碱墓精确率等方面,考察了制备双链DNA的各种方法,包括小型制备一水煮法,小型制备一碱法,氮化艳制备法,Stratagene过柱法,Qiagen过柱法。采用质粒pBlueseript IIKS、ABI Taq引物循环侧序药盒及AIB Taq染料脱氧终止子循环测序药盒,对DNA进行自动测序。Stratagene或Q二age。层析给出高纯度DNA,使测序范围…     

土壤样品中DNA提取方法的比较

对土壤样品中提取DNA方法的有效性进行了比较研究。如果以细胞有效裂解和DNA产率为标准,用冻融进行预处理再结合SDS和溶菌酶的化学裂解方法,是效果最佳的DNA抽提方法,细胞裂解率为82%,DNA产率达20.8μg/g。为了去除PCR抑制物,将DNA样品进一步用柱纯化,回收率为80%。纯化后的DNA样品可用于16SrDNA扩增及其他分子操作。     

补骨脂素—UVA对端粒DNA的直接作用及其原子力显微镜研究

HeLa细胞DNA,经Rsal(1250U)和HinF1(1250U)内切酶酶解、Bio-gel P-2柱分离,得到端粒DNA。原子力显微镜（AFM）的直接观测结果表明在UVA照射下,补骨脂素可结合到端粒DNA的特殊位置,其光交链产物随照射时间增长而增加。与此同时,P53表达和端粒酶活性发生变化。纯化的端凿DNA片段在AFM下呈带尾的T－环结构（T-loop）。按其高度判断T－环部分为双链DNA结构,T－环与尾部交接处具有三链或四链结构特征。     

用硫酸铵沉淀法从液体培养物中纯化噬菌体λDNA

噬菌体是近年来DNA克隆最常用的载体之一。因此高质量的λDNA的制备是DNA重组的一项关键性技术。所谓高质量的λDNA制品应不被宿主菌的DNA所污染,DNA链必需完整而不被折断成碎片,并能被工具酶所加工。迄今制备λDNA的方法的主要差别在于对噬菌体颗粒的纯化步骤并存在一些缺点:PEG沉淀结合CsCI梯度离心法费用大。得率低,而且费时,不适合于多个样品DNA的快速提纯。纤维素酶DE-52层析法的缺点是大量的溶菌物过柱后,DE-52会结块,而且要有多套层析设备。直接从PEG沉淀的噬菌体颗粒提取的DNA往往纯度不高,需要有亚精胺存在时才能被限制性内切酶所切割。1989年,Ziai等首先用(NH_4)_2SO_4从平板培养法制备的噬菌体溶菌物中沉淀λgtll颗粒。用RNase处理去除污染的宿主菌RNA后,先用蛋白酶K,再用NaOH处理使λ噬菌体颗粒裂解,再用酚抽     

一种改良的大豆线粒体DNA提取方法

以大豆(Glycine max (L.) Merrill)黄化苗为材料,通过优化提取线粒体DNA(mtDNA)时差速离心过程中的离心力和离心时间,以及纯化过程中设置不同的蔗糖密度梯度和裂解液浓度,结合高盐法去除蛋白质,改良大豆mtDNA的提取方法。结果表明,该方法提取的mtDNA浓度和纯度较高,无叶绿体和核基因组DNA的污染,可用于后续大豆线粒体基因组的相关研究。     

大肠杆菌pFD7质粒DNA的分离纯化及分子特性的研究

我们研究了PFD7质粒DNA的抗变能力及其纯化方法。经试验,pFD7质粒DNA在100℃处理2—4分钟可保持85％以上的转化活性,处理10分钟转化活性降到50％以下,处理20分钟仅剩10％左右,而在pH12.5处理3—5分钟,转化活性没有下降。 经琼脂糖凝胶电泳鉴定,经上述热或碱处理后pFD7质粒DNA电泳带不变,而染色体DNA在100℃处理2分钟或pH12.5处理3—5分钟即发生变性并显著降解,原电泳带消失。从pFD7质粒DNA分别对热和碱的稳定性可推知它主要以CC-DNA形态存在。     

风沙土微生物总DNA不同提取和纯化方法比较

为筛选和建立风沙土中总DNA的提取和纯化方法,选取了5种直接提取法、1种间接提取法和2种纯化法分别对风沙土中总DNA进行了提取和纯化,并对其质量和产量进行了比较.结果表明：6种方法均可从风沙土中提取到大小为23 kb左右的总DNA,其中改进后的高盐提取法（用40%聚乙二醇8000和4 mol·L^-1 NaCl沉淀DNA）效果最好,纯化后总DNA的纯度最高,可进行16S rDNA的PCR扩增,且产量仅稍低于试剂盒提取法;电泳加柱回收纯化法的纯化效果较好,经该方法纯化后的总DNA大部分可进行PCR扩增,可满足后续分子操作对DNA纯度的要求.     

旋覆花的化学成分研究(英文)

通过应用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20柱色谱,以及高效液相制备色谱等手段,从旋覆花地上部分分离纯化得到10个化合物,再通过光谱学方法,并结合化合物的理化性质鉴定为泽兰内酯(1)、7-羟基香豆素(2)、瑞香素(3)、东莨菪素(4)、蟛蜞菊内酯(5)、枸橼苦素(6)、杜仲树脂酚(7)、丁香酸(8)、香草酸(9)和异丁香酸(10)。化合物1～10均为首次从旋覆花属植物中分离得到。     

用改良酸酚法从大肠杆菌中大量分离纯化质粒DNA

在进行DNA重组和大量制备’2p标记的 DNA分子探针过程中,我们参照Clewell等〔41清 亮裂解液方法和Zasloff等fsl的酸酚法,综合发 展了一种大量分离纯化质粒DNA的清亮裂解 液一酸酚法此方法操作简便、重复性好、产量高, 其纯度和生物活性可满足DNA重组与制备32p 标记DNA探针的要求,既省去了昂贵费时的 氯化艳一澳化乙咤密度梯度超离心,又避免了细 菌裂解液直接酚提时溶液过于粘稠、不易操作、 收率低的缺点。并证实了经酸酚处理后的质粒 DNA可用于DNA重组。     

菱镁矿区镁粉尘污染土壤的植物修复效果评价

菱镁矿在开采和煅烧过程中产生的镁粉尘严重损害矿区土壤性质和植被生长,然而至今对菱镁矿污染土壤修复仍无成熟的方法。本研究通过不同添加量镁粉尘处理(0、2%、5%和10%)以及配合施用磷酸二氢钙[Ca(H2PO4)2·H2O]的盆栽实验,探讨羊草(Aneurolepidium chinense)、披碱草(Elymus dahuricus)、剪股颖(Agrostis stolonifera)和碱茅(Puccinellia distans)对菱镁矿区镁粉尘污染土壤的修复效果。结果表明:羊草和披碱草对土壤镁粉尘污染具有极强的耐性,而剪股颖和碱茅耐性中等;4种植物对土壤镁的富集能力均不强,地上部分镁浓度为1.6~8.6 g·kg-1,生物富集系数均小于1,转运系数为0.5~3.1。在轻度镁粉尘污染处理中,4种植物对土壤镁有较好的去除效果;配施Ca(H2PO4)2·H2O显著促进了镁粉尘处理植物的生长,提高了植物对土壤镁的去除能力,在中度和重度镁污染处理的效果更强。因此,在轻度镁粉尘污染土壤上,配施Ca(H2PO4)2·H2O、种植碱茅和羊草,不但能恢复菱镁矿区废弃地植被,还能有效去除土壤镁;对于中度和重度镁粉尘污染土壤,可通过配施Ca(H2PO4)2·H2O、种植羊草和披碱草来加快菱镁矿区废弃地的植被恢复。     

LPTS抗体的制备和活性检测

LPTS是利用定位候选克隆策略 ,得到的一个新的肝相关候选肿瘤抑制基因 (anovelliver relatedputativetumorsuppressor) ,为了进一步研究其结构与功能 ,利用DNA重组技术 ,将LPTS的cDNA克隆到融合表达载体pET 2 4a中 ,在E .coli中表达 ,以Ni+柱亲和层析 ,获得纯化的 6×His LPTS融合蛋白。以此为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体 ,ELISA法检测其滴度达 2 0 0 0 0以上 ,经亲和层析纯化 ,Western印迹结果表明 ,该纯化抗体可与真核表达的HA LPTS蛋白和内源性的LPTS蛋白特异性结合 ;免疫荧光分析显示SMMC 772 1细胞内源性表达的LPTS蛋白呈点状分布于细胞核内。以上结果表明获得了效价高 ,活性强的针对LPTS蛋白的多克隆抗体 ,可用于对LPTS的结构和功能研究。     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅲ.三尖杉酯碱抑制作用动力学及其衍生物作用的比较

本文报告了三尖杉酯碱抑制艾氏腹水癌细胞DNA聚合酶α的动力学。三尖杉酯碱的抑制作用与反应体系中的模板DNA量有关,过量的DNA可降低药物的抑制作用,但不能完全消除药物的抑制。并证明三尖杉酯碱与模板DNA对DNA聚合酶α是混合型抑制,当三尖杉酯碱浓度为10μM时,其K_i值为9.5μM,K_m值为13μg DNA/100μl。三尖杉酯碱抑制DNA聚合酶α的能力不受反应体系中四种脱氧核苷三磷酸底物浓度的影响,通过同时改变四种底物浓度,或固定三种底物浓度只改变其中一种底物的量,或采用限制性DNA合成系统(Limited DNA Synthesis)即在完全体系中省略去某一底物,均证明三尖杉酯碱与四种底物对DNA聚合酶α为非竞争性抑制,当三尖杉酯碱浓度为4μM时,对dCTP、dGTP和dTTP的K_i值分别为12μM、11μM和12μM。本文也比较了三尖杉酯碱衍生物——高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和表三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的抑制作用。结果表明,当药物浓度相同时,高三尖杉酯碱的作用较三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱强,而三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱的作用相近;表三尖杉酯碱本身对DNA聚合酶α无抑制作用,也未见其在无细胞系统中对三尖杉酯碱的抑制能力有加强作用。以上药物对E.coli DNA聚合酶Ⅰ也有相似的抑制作用。     

荷叶中的生物碱及其对5-HT 2A和5-HT 2C受体的激动作用研究CSCD

对荷叶中的生物碱进行了分离、鉴定和调脂减肥活性研究。本研究结合传统酸提碱沉法与现代高效液相色谱制备技术,从荷叶中分离、纯化到11个生物碱,分别被鉴定为N-氧基原荷叶碱(1)、原荷叶碱(2)、莲碱(3)、降氧化北美黄连次碱(4)、荜茇宁(5)、巴婆碱(6)、O-去甲基荷叶碱(7)、N-去甲基荷叶碱(8)、荷叶碱(9)、衡州乌药碱(10)和亚美罂粟碱(11),其中,化合物1、4和5为首次从荷叶中分得。测试所得化合物对5-HT_(2A)和5-HT_(2C)受体的激动作用,结果表明11个生物碱对5-HT_(2A)受体均具有一定的激动作用,进一步揭示了荷叶调脂减肥的可能药效基础和作用机理。     

一种简便快速提取和透析昆虫杆状病毒DNA的方法

经几次蔗糖梯度离心纯化的多角体病毒或颗粒体病毒,在0.05MNa_2CO_3-0.01M EDTA-0.17M NaCl(pHl0.9)的碱解液中碱解之后,直接用苯酚抽提,乙醇沉淀DNA,DNA在照有透析膜的Enpendorf离心管内以TE缓冲液透析,这样提取的DNA用凝胶电胶检查仅为单一DNA带,其2600D/2800D的比值为1.82。     

两种外周血 DNA 提取方法的比较

目的:外周血DNA的提取是研究乙型肝炎病毒相关临床疾病的基础,所提取DNA的质与量直接关乎下游研究的成败,经济、高效、便捷的外周血DNA提取方法对于疾病分子水平的研究尤为重要,本实验旨在比较两种外周血DNA提取方法,从而为临床研究提供有力的参考。方法:以外周抗凝血为试验样本,分别采用改良盐析法和DNA提取试剂盒法(硅胶柱纯化)进行基因组DNA的提取,通过分光光度仪测量DNA浓度和纯度,并进行PCR扩增及电泳实验。比较改良盐析法与试剂盒提取法(硅胶柱纯化)的效果。结果:试剂盒提取法(硅胶柱纯化)标本用量甚微,省时,提取DNA纯度高,步骤繁琐,PCR条带单一、亮度差;改良盐析法操作步骤少,提取DNA浓度高,PCR条带亮度佳、杂带多,耗时长。结论:两组方法各有优缺点,试剂盒提取法(硅胶柱纯化)可靠、快速,但所获DNA量少、极易降解,改良盐析法耗时,但所获DNA浓度高、量多,可根据实验时间与经费,实验所需的DNA纯度与浓度,提供的样本体积等不同的临床研究需求及条件来综合选择适宜的提取方法。     

氨基酸制备色谱——丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率研究

现代液相色谱已从分析色谱发展到制备色谱,为了研究氨基酸制备色谱柱柱效率,我们从液相色谱理论的十几个基本关系式中归纳出五个基本方程式,用以评价丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率。初步试验结果表明,对强酸性阳离子交换树脂柱而言: 1.凝胶型离子交换树脂柱柱效率高于普通大孔型离子交换树脂柱柱效率,而与本室合成的Dpsc大孔型离子交换树脂柱柱效率相当。 2.凝胶型离子交换树脂中,低交联度离子交换树脂有利于提高缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率,可较好地分离缬氨酸和亮氨酸;较高交联度离子交换树脂有利于提高丙氨酸和缬氨酸制备柱柱效率,可较好地分离丙氨酸和缬氨酸。将不同的离子交换树柱组合起来,可以提高丙氨酸,缬氨酸和亮氨酸的分离度,提高氨基酸的回收率。这项研究成果已应用到从猪血粉、猪毛等天然蛋白质酸水解物中系统分离多种氨基酸,以及分别从缬氨酸、亮氨酸(异亮氨酸)发醇液中分离纯化缬氨酸、亮氨酸(异亮氨酸)。