黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建及其功能分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)GICC2773基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1．4kb和下游约1．3kb两段DNA序列,将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5′和3′端,构建成重组质粒pMW1-pepB,用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。同源重组则采用原生质体-PEG方法,将酶切pMW1-pepB得到的线性片段转化A．niger GICC2773菌株,通过潮霉素选择平板得到62个Hgy抗性转化子,然后采用PCR方法从这些抗性转化子中筛选到1个由于同源重组产生的pepB基因缺失突变菌株pepB29。功能分析显示该突变株的酸性蛋白酶活性有明显下降,外源蛋白漆酶的分泌表达有所提高。     

利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌asa A基因

目的利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌ATCC 17978的asaA。方法设计上下游引物中包含asaA的同源序列,并以pKD4质粒为模板,扩增含有卡那霉素抗性基因的DNA片段。将该片段转化于表达重组酶的17978感受态细胞中,在卡那霉素筛选压力下,得到经两次同源双交换的具有卡那霉素基因标记的突变菌株。随后,在重组酶的作用下将抗性基因去除,最终得到无抗性基因标记的突变菌株ΔasaA。结果通过该重组系统,首先将卡那霉素抗性基因的DNA片段替换了基因组中asaA的DNA片段,然后将卡那霉素抗性基因的DNA片段消除,最终获得了asaA缺失的突变体。结论通过Red重组系统为鲍曼不动杆菌中其他基因的缺失突变提供方法与思路。     

PEG介导的黑附球菌遗传转化体系的建立

以生防真菌黑附球菌原生质体为受体、潮霉素抗性基因（ hph）为筛选标记,应用PEG介导法进行了遗传转化体系的研究。潮霉素敏感性测试结果表明,黑附球菌对潮霉素的耐受浓度为50mg/L。PEG介导的黑附球菌原生质体最佳遗传转化体系为：30℃下用2%裂解酶酶解黑附球菌菌丝2h,过滤收集原生质体,经MTC清洗重悬后将质粒pYF11-hph转化黑附球菌原生质体,在RM培养基中混匀再生;经潮霉素药剂筛选和PCR验证,表明外源基因 hph已转入到黑附球菌中并获得稳定表达。本实验成功地建立了稳定的PEG介导的黑附球菌遗传转化体系,为研究其代谢途径、生防机制及构建工程菌株提供了技术保障。     

酿酒酵母HOR2基因缺失突变株的构建

目的:构建酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株并研究其对甘油和乙醇产量的影响。方法:以PCR为基础,通过同源重组的方式使目的基因缺失。结果:通过设计含有与HOR2(GPP2)基因两侧序列同源的长引物,以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母HOR2基因敲除组件,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS2,获得为loxP-kan-loxP序列组件所替换而产生kanr的阳性克隆子。然后再将质粒PSH65转入阳性克隆子诱导表达Cre酶切除筛选标记,在原ORF基因处保留一个loxP位点,丢失质粒后获得HOR2单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除。发酵实验表明,突变株甘油产量降低3.34%,乙醇产量提高1.96%。结论:成功获得了酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株,并命名为YS2-HOR2。     

一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统

随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。嗜盐古菌Haloferax volcanii易于培养,是研究古菌基因功能的良好模式菌株。虽然现已开发了多种嗜盐古菌的遗传操作系统,但基因敲除成功率不十分理想。这些遗传操作方法基于pyrE筛选标记,利用携带同源片段的环状质粒与基因组同源片段间的两次同源重组,敲除目的基因。由于基于环状质粒和pyrE筛选标记的经典同源重组敲除方法在二次重组时,普遍存在回复到野生型菌株的可能,导致二次重组子中敲除目的基因的阳性菌株比例较低。为了克服传统同源重组技术的上述缺陷,文章建立了基于线性DNA片段的同源重组技术。该方法通过一次重组在目标基因的下游引入一段上游同源片段和pyrE标记,从而限定二次重组的发生部位只能在两段上游同源片段之间,发生二次重组的重组子理论上都敲除了目标基因。利用该方法,文章成功敲除了嗜盐古菌Haloferax volcanii的xpd2基因,阳性克隆率达65%。这种线性DNA片段重组法为嗜盐古菌的基因敲除提供了一种高效策略,便于嗜盐古菌的基因改造。     

利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌

利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5 L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065 L-苏氨酸的产量为5.55±0.51 g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065 L-苏氨酸产量为9.77±1.83 g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸产量为8.65±1.42 g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14 g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L 苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。     

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。     

基因编辑技术对大肠杆菌yjjW基因点突变的两步法策略

【目的】为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略。【方法】将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基因敲除菌株。随后,靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统。首先,设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列,并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂,将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接,获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR;接着,将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株;最后,利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白,发生DNA同源重组,获得靶基因点突变菌株。【结果】利用上述方法,既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7ΔyjjW::ampR,又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变,获得点突变菌株D7yjjW-24。【结论】本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法,amp基因的插入提供了有效的筛选标记,此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer,可应用于同种菌株其他靶基因的点突变,能够缩短后续实验操作,为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础。     

杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建

【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。     

PEG法介导蛹虫草遗传转化体系的建立

由于真菌的遗传转化体系中一般以原生质体作为受体细胞,因而对蛹虫草原生质体制备的各种因素进行比较研究。结果表明,蛹虫草原生质体制备的最佳体系为:液体培养4天的蛹虫草菌球,以0.8 mol/L甘露醇作为稳渗剂,加入含1.5%蜗牛酶+1.5%溶壁酶复合酶,在34℃酶解蛹虫草菌球4 h时,原生质体得率达到1.0×10~7个/ml。潮霉素筛选压实验表明,蛹虫草原生质体在PDA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为650 mg/L。采用正交试验的方法,设计PEG介导蛹虫草原生质体转化,将质粒p SB130-GFP转化蛹虫草原生质体,在荧光倒置显微镜下观察比较,得到最佳的转化体系为:PEG浓度为25%,冰浴时间为10 min,室温时间为20 min,质粒质量为30μg,原生质体个数为10~7个/ml。最终得到PEG法介导蛹虫草遗传转化的转化频率约为100~200个/μg(抗性转化子/质粒+10~7个原生质体)。转化子在含潮霉素的培养基上经4代以上的继代培养后仍可以表达潮霉素抗性并稳定遗传。为通过基因工程手段定向、快速改良蛹虫草药用品质,利用蛹虫草发酵方法生产一些具有重大经济价值的外源蛋白等奠定基础,并且有助于进一步了解蛹虫草这一大型真菌中基因的表达调控机制。     

PEG介导的柱状田头菇遗传转化体系建立

柱状田头菇（茶树菇）Agrocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有极高的经济价值。随着其全基因组测序的完成,功能基因组学研究也逐渐展开,其中,高效的遗传转化体系作为技术基础成为研究重点。本研究以柱状田头菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因（hph）作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因,应用PEG介导法进行柱状田头菇遗传转化体系研究。结果表明,150μg/mL潮霉素可以完全抑制柱状田头菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3h,能够获得最大得率的原生质体。通过PEG介导将构建好的DNA片段转化入柱状田头菇原生质体,通过潮霉素抗性筛选获得转化子,转化得率达到7个/μg DNA。PCR验证和荧光显微镜观察,外源片段成功转入柱状田头菇中并稳定表达。本研究建立的PEG介导转化体系,为柱状田头菇基因功能研究提供了技术基础。     

深海白色侧齿霉遗传转化体系建立及渗透压调控相关的EaSHO1基因功能

海洋中具有丰富的动植物及微生物资源,海洋真菌是其重要组成之一.我们前期的研究发现一株深海真菌白色侧齿霉Engyodontium album能产生具有抑菌活性的次级代谢产物engyodontiuminA,该化合物能抑制黑曲霉、金黄色葡萄球菌及创伤弧菌等病原菌的生长,是一种潜在的海洋源抗菌药物.目前,该菌遗传转化体系尚未建...     

PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立

对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为：液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI-hph（含有灵芝gpd1-Gl启动子和潮霉素抗性基因hph）转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。     

Efficient integrative transformation of the phytopathogenic fungus Alternaria alternata mediated by the repetitive rDNA sequences

An attempt was made to transform Alternaria alternata protoplasts using a plasmid vector, pDH25, bearing the Escherichia coli hygromycin B (Hy) phosphotransferase gene (hph) under the control of the Aspergillus nidulans trpC promoter. Transformants arose on a selective medium containing 100 μg Hy/ml. There were two types of transformants, forming large and small colonies on the selective medium. Transformation with one μg of the vector produced an average of 4.5 large colonies and 600 small ones. In large-colony transformants, the vector often integrated into the recipient chromosome in the form of highly rearranged tandem arrays. To increase transformation efficiency, fragments of the highly repetitive ribosomal RNA gene cluster (rDNA) of A. alternata were used to construct four new vectors for homologous recombination system. Use of these vectors gave higher transformation efficiency than the original plasmid. The best vector, pDH25r1a, gave rise to large-colony transformants at a frequency 20 times higher than pDH25. Transformation events in A. alternata with pDH25r1a occured by homologous recombination as a single crossover between the plasmid-borne rDNA segment and its homologue in the chromosome, often giving rise to tandemly repeated vector DNA.     

赤霉菌原生质体DNA转化*

Methods for the protoplast preparation and DNA transformation of Gibberella fujikuroi were established. The protoplasts were transformed with plasmid pAN7-1, which carries hygromycin B resistant gene (hPh), and the transformation frequency was about 10. Some transformants grew vigorously on the selectivemedium containing 400μg / ml of hygromycin B, while the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotic to the recipient strain was oniy 20μg / ml. Southern hybridization showed that the hph gene ha…     

A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants

We have established an efficient procedure for protoplast transformation and regeneration of fertile transgenic plants of rice (Oryza sativa L.) cultivars Nipponbare and Taipei 309. Protoplasts were mixed with a plant-expressible hygromycin resistance gene and treated with 25% (w/v) polyethylene glycol. Stringent selection of transformed colonies was applied to 14-day-old regenerated protoplasts in the presence of 95 micromolar of hygromycin B for 12 days. After selection, 450 and 200 resistant colonies were recovered per million treated Taipei 309 and Nipponbare protoplasts, respectively. Southern hybridization analysis of hygromycin-resistant cell lines and regenerated plants indicated that 1 to 10 copies of transferred DNA were integrated at 1 to 4 loci of the rice genome. Southern DNA analysis suggests that the introduced plasmid DNA may form concatemers by intermolecular recombination prior to integration. Four Taipei 309 and 39 Nipponbare transgenic rice plants were regenerated and grown to maturity in the greenhouse. Two Taipei 309 and 35 Nipponbare plants set viable seeds. Agronomic traits of Taipei 309 transgenic plants and inheritance of the hygromycin resistance trait by progeny of the selfed transgenic plants were analyzed.     

红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30~40 h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为：0.3 % lysing enzyme、0.1 % cellulase和1 % snailase的酶组合,30℃作用2.5 h;最适渗透压稳定剂是：1mol /L MgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6 mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5 %和36.4 %。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC-Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA克获得100个稳定转化子。     

猕猴桃间座壳菌Diaporthe actinidiae的绿色荧光蛋白基因标记及侵染过程

果实软腐病是猕猴桃贮藏期间最严重的真菌病害,猕猴桃间座壳Diaporthe actinidiae是该病检出率最高且致病力最强的病原菌.该病菌从花前期开始侵染,至果实贮藏期才表现症状,侵染至发病周期较长,可借助荧光标记对其侵染过程进行研究.本研究采用PEG介导原生质体转化的技术,运用携带GFP及潮霉素抗性基因的双元载体p...     

Agrobacterium-mediated transformation leads to improved gene replacement efficiency in Aspergillus awamori

In this study, the efficiency of gene replacement in Aspergillus awamori between Agrobacterium-mediated transformation and CaCl(2)/PEG-mediated transformation was compared. For the genes, pyrG and gfaA, it was found that the homologous recombination frequencies obtained by Agrobacterium-mediated transformation were 3- to 6-fold higher than the frequencies obtained with CaCl(2)/PEG protoplast transformation. For the pyrG gene, it was found that Agrobacterium-mediated transformation allowed an efficient homologous recombination with shorter DNA flanks than CaCl(2)/PEG protoplast transformation. Finally, the addition of the dominant amdS marker as a second selection marker to the gene replacement cassette led to a further 2-fold enrichment in transformants with gene replacement events, resulting in a gene replacement frequency of 55%. Based on the data it can be concluded that Agrobacterium-mediated transformation is an efficient tool for gene replacement and that the amdS gene can be successfully used as a second selection marker to select transformants with putative gene replacement.