监测活细胞中诱导激活的Rac、Cdc42时空图像的FRET单分子探针的构建

以PCR方法从人脑cDNA基因文库扩增Rac1、Cdc42 cDNA全序列及其效应蛋白基因Pak1、N-WASP的GTP酶联结区域(GBD)序列,从dsRed1-N1质粒扩增红色荧光蛋白dsRed1cDNA全序列.将cDNA序列依次定向克隆至pECFP-N1质粒载体,获得基于FRET原理,包含dsRed1,Pak1或N-WASP的GBD,Rac1或Cdc42,ECFP编码序列的单分子探针.在dsRed1的C末端加入一段CAAM法尼基化基序,构建包含EGFP,Pak1的GBD,Rac1或Cdc42,dsRed1-CAAM的质膜特异表达的单分子探针.采用这两种探针,可用于监测活细胞中诱导激活的Rac1、Cdc42信号转导通路的3D时空图像,检测待测蛋白分子的GEF或GAP活性.     

二十二碳六烯酸增强MDA-MB-231细胞对5-FU敏感性的研究

目的:探讨二十二碳六烯酸(DHA)对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的作用及对Wnt/1β-Catenin信号传导通路的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT),测定DHA对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性的作用;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;RT-PCR检测MDA-MB-231细胞β-catenin、GSK-3β基因的表达情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞3-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白的表达情况;细胞免疫组化染色观察DHA及DHA联合Licl对3-Catenin蛋白细胞内表达及定位的影响.结果:20 μg/ml、40μg/ml的DHA分别与5-FU联合应用,可增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用.DHA(20 μg/ml)能促进5-FU增强MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞作用、降低细胞增殖指数及诱导细胞的凋亡.DHA作用于MDA-MB-231细胞后,β-catenin基因及蛋白表达水平下降(P＜0.05)、GSK-3β的基因及蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05),磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白表达水平下降(P＜o.05).结论:DHA能增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡,起化疗增敏作用,可能与其通过抑制GSK-3β磷酸化来阻断Wnt/β-Catenin信号通路有关.     

Rho GTPases对肿瘤血管生成相关分子的作用

探讨RhoGTPases的 3个主要分子RhoA、Rac1和Cdc4 2对肿瘤血管生成相关分子的作用 .构建负显性RhoA、Rac1和Cdc4 2的真核表达质粒 ,在Lipofectamine2 0 0 0 介导下转染胃癌细胞AGS ,应用ELISA检测细胞培养上清中VEGF的含量 ,应用Western印迹检测肿瘤血管生成相关分子HIF 1α、P5 3和PTEN的表达水平 .成功地构建了负显性RhoA、Rac1和Cdc4 2的真核表达质粒 ,转染胃癌细胞AGS并经G4 18筛选出单克隆 .ELISA表明转染细胞培养上清中VEGF的含量可被明显抑制 ;Western印迹表明 ,负显性RhoGTPases在蛋白水平上可下调HIF 1α表达水平 ,上调P5 3的表达水平 .结果表明 ,Rho家族的 3个主要分子可能通过调节血管生成相关分子的表达来促进肿瘤血管生成 .     

监测活细胞中诱导激活的Rac、Cdc42信号转导通路的FRET单分子探针

Rho家族鸟苷三磷酸酶,包括Rac1和Cdc42等．参与调节细胞形态、细胞迁移、转录激活和基因表达等一系列细胞过程。根据FRET（Fluorescent resonance energy transfer）技术原理,构建了包含红色荧光蛋白dsRed1与青色荧光蛋白ECFP的全长cDNA．效应分子Pak1或N—WASP的GTP酶联结区域．信号分子Rac1或Cdc42的全长cDNA的几种单分子探针。转染NIH3T3或Hela细胞,以胰岛素、缓激肽为诱导剂,分别激活Rac1、Cdc42信号转导通路。离体荧光光谱检测表明．在两种转染动物细胞中均产生了FRET现象。不同信号转导通路的FRET效率,在诱导激活5min后,均达到最高值,但增加幅度有显著差异。随着诱导时间的延长,FRET效率下降,但下降速率在不同信号转导通路间差异显著。Rac1、Cdc42激活试验证实．诱导激活的转染细胞中,Rac1、Cdc42均处于激活状态（GTP—bound）,其在不同诱导时间的相对激活程度与FRET效率表现相同。诱导激活的Rac1、Cdc42信号转导通路,分别导致了转染活细胞中片状伪足、线状伪足的产生。这表明,采用这些单分子探针,可直接监测激活的信号转导通路,在活细胞中的3D时空分布变化图像及其产生的细胞学效应。采用这些单分子探针．分析、判断了一些调节蛋白对Rac1、Cdc42的GEF或GAP特性。从而提供一种可大大简化现有的鉴定待测蛋白分子的方法。     

二十二碳六烯酸促进无葡萄糖条件下乳腺癌细胞MDA-MB-231死亡

为了探究二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)抗乳腺癌的机制,采用流式细胞术分析细胞死亡率,H2DCFDA探针流式细胞术测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blotting方法检测细胞内剪切型Caspase-3的变化。结果发现在无葡萄糖条件下,DHA以浓度依赖性方式促进乳腺癌细胞MDA-MB-231死亡。在这个过程中,DHA促使细胞内ROS水平明显升高,然而,当DHA和抗氧化剂N-乙酰-半胱氨酸(N-acetyl-L-cystein,NAC)共处理细胞时,细胞死亡率和细胞内ROS水平均明显降低。Western blotting检测结果表明DHA可以引起Caspase-3的切割,同时,这种变化可以被NAC抑制。结果表明在无葡萄糖条件下,DHA可以通过增加细胞内ROS的水平,激活Caspase凋亡通路,进而促进乳腺癌细胞MDA-MB-231死亡。     

缺氧缺血诱导对原代新生大鼠前脑混合细胞髓鞘形成和细胞骨架的影响

目的:该研究探讨了缺氧缺血诱导对新生大鼠前脑混合细胞髓鞘形成和细胞骨架的影响。方法:在原代培养的新生大鼠前脑混合细胞中,应用免疫组化染色髓鞘碱性蛋白(MBP)和劳克坚牢蓝(LFB)染色检测髓鞘和轴突的发育情况;Western印迹分析NF155蛋白的表达情况;免疫荧光分析参与细胞骨架调节的ERM-Rho GTP酶家族相关蛋白表达。结果:缺氧缺血对混合细胞的进一步分化和成熟起到抑制作用,MBP染色阳性率降低57%,髓鞘和轴突染色阳性率降低74%;NF155蛋白表达降低51%;Rho GTP酶家族成员Rac1、Cdc42分别降低81%和75%。结论:缺氧缺血使细胞突起的形成和骨架重组受到阻碍,继而影响髓鞘的发育和成熟,这一过程与ERM-Rho GTP酶细胞骨架通路有关。     

p21活化激酶的生物学活性及其与肿瘤的关系

p21活化激酶(p21-activatedkinase,PAK),为一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAK在许多组织中广泛表达,作为小G蛋白Rho家族Cdc42和Rac1的下游靶蛋白,可以被生长因子及其他胞外信号通过GTP酶依赖的信号通路或非GTP酶依赖的信号通路活化,发挥多种生物学效应。PAK作为一种重要的生物学调节因子,在哺乳动物一系列细胞功能中具有重要作用,如:细胞运动、细胞生存、细胞周期、血管生成、基因转录调节及癌细胞的侵袭转移。通过对PAK家族成员信号转导机制的研究,为癌症治疗提供分子靶标。     

ω-3多不饱和脂肪酸抗肿瘤新途径——抑制具核梭杆菌黏附宿主细胞

【背景】大量文献报道ω-3多不饱和脂肪酸尤其是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)与二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)具有抗肿瘤作用,但是其抗肿瘤机制还不够完善。【目的】探究ω-3多不饱和脂肪酸、具核梭杆菌以及结直肠癌三者之间的关联。【方法】在检测二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸(α-Linolenic Acid,ALA)等ω-3多不饱和脂肪酸对人结直肠腺癌细胞Caco-2、正常结肠上皮细胞NCM460生长影响的基础上,检测DHA等3种多不饱和脂肪酸对具核梭杆菌黏附人体细胞以及Fap2、FadA、RadD等具核梭杆菌毒力关键基因表达的影响。【结果】30μg/mL的DHA、EPA、ALA对Caco-2生长抑制分别为9.09%、4.95%、7.52%,而对NCM460生长抑制达31.15%、25.48%、29.11%,而且相关抑制作用仅具有浓度依赖性而无时间依赖性。经30μg/mL的DHA、EPA、ALA预处理的具核梭杆菌黏附Caco-2细胞的能力分别下降81.04%(P=0)、93.63%(P=0)和68.63%(P=0);而共培养时加入DHA、EPA、ALA对具核梭杆菌黏附Caco-2细胞的能力没有显著影响。同时,30μg/mLDHA处理导致F.nucleatum的Fap2基因显著下降10.22%(P=0.027);30μg/mL EPA处理导致FadA、Fap2基因分别显著下降23.49%(P=0)、15.09%(P=0.003);30μg/mL ALA处理导致FadA基因显著下降26.75%(P=0.012)。【结论】综合上述实验结果以及DHA、EPA、ALA仅能短时间抑制具核梭杆菌生长等文献报道,我们认为,DHA、EPA等ω-3多不饱和脂肪酸并非简单地直接杀伤或抑制肿瘤细胞和F.nucleatum;抑制FadA、Fap2等黏附相关基因表达,降低F.nucleatum黏附宿主细胞能力是其抗肿瘤作用的关键组成部分。ω-3多不饱和脂肪酸等活性物质对F.nucleatum等在结直肠肿瘤发生、发展中发挥重要作用的肠道细菌的影响与机制应深入开展研究。     

Rho小G蛋白相关激酶的结构与功能

Rho小G蛋白家族是Ras超家族成员之一,人类Rho小G蛋白包括20个成员,研究最清楚的有RhoA、Rac1和Cdc42。Rho小G蛋白参与了诸如细胞骨架调节、细胞移动、细胞增殖、细胞周期调控等重要的生物学过程。在这些生物学过程的调节中,Rho小G蛋白的下游效应蛋白质如蛋白激酶（p21-activated kinase,PAK）、ROCK（Rho-kinase）、PKN（protein kinase novel）和MRCK（myotonin-related Cdc42-binding kinase）发挥了不可或缺的作用。迄今研究发现,PAK可调节细胞骨架动力学和细胞运动,另外,PAK通过MAPK（mitogen-activated protein kinases）参与转录、细胞凋亡和幸存通路及细胞周期进程;ROCK与肌动蛋白应力纤维介导黏附复合物的形成及与细胞周期进程的调节有关;哺乳动物的PKN与RhoA/B/C相互作用介导细胞骨架调节;MRCK与细胞骨架重排、细胞核转动、微管组织中心再定位、细胞移动和癌细胞侵袭等有关。该文简要介绍Rho小G蛋白下游激酶PAK、ROCK、PKN和MRCK的结构及其在细胞骨架调节中的功能,重点总结它们在真核细胞周期调控中的作用,尤其是在癌细胞周期进程中所发挥的作用,为寻找癌症治疗的新靶点提供理论依据。     

ω-3脂肪酸对人滋养层细胞侵袭和血管生成的影响

摘要 目的：探讨ω-3脂肪酸对人滋养层细胞（HTR-8/SVneo）侵袭和血管生成的影响。方法：本实验设置了不同浓度二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）处理组,依次为0、1、50和100 μmol/L EPA组;0、1、50和100 μmol/L DHA组。各组HTR-8/SVneo细胞分别用相应浓度的EPA和DHA培养48 h。然后通过CCK-8法检测细胞增殖,Matrigel Transwell实验检测细胞侵袭。使用EPA和DHA处理的HTR-8/SVneo细胞的上清液培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）6 h,然后检测HUVEC的小管形成能力。通过qRT-PCR和Western blot检测HTR-8/SVneo细胞中三结构域蛋白22（TRIM22）、信号转导和转录激活因子1（STAT1）、p-STAT1（Tyr701）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP9和VEGF的表达。结果：与0 μmol/L EPA组或0 μmol/L DHA组相比,50 μmol/L EPA组、100 μmol/L EPA组、50 μmol/L DHA组和100 μmol/L DHA组的OD_450nm 、侵袭细胞数量、MMP2和MMP9的蛋白相对表达量均升高（P<0.05）。与0 μmol/L EPA组或0 μmol/L DHA组相比,50 μmol/L EPA组、100 μmol/L EPA组、50 μmol/L DHA组和100 μmol/L DHA组的相对小管长度和VEGF蛋白相对表达量均升高（P<0.05）。与0 μmol/L EPA组或0 μmol/L DHA组相比,50 μmol/L EPA组、100 μmol/L EPA组、50 μmol/L DHA组和100 μmol/L DHA组的TRIM22 mRNA和蛋白相对表达量均升高,而STAT1 mRNA相对表达量和p-STAT1 (Tyr701)蛋白相对表达量均降低（P<0.05）。结论：ω-3脂肪酸处理可促进滋养层细胞的侵袭性和血管生成,其机制可能与TRIM22的上调和STAT1活性的抑制有关。     

基于核因子相关因子2/血红素加氧酶-1信号通路探讨异荭草素对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响

摘要 目的：探讨异荭草素（ISO）对乳腺癌（BC）细胞恶性生物学行为及核因子相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路的影响。方法：体外培养人BC细胞系MDA-MB-231并分组：MDA-MB-231组、MDA-MB-231+ISO组（100 μmol/L ISO处理）、MDA-MB-231+ISO+OE-NC组（转染OE-NC后用100 μmol/L ISO处理）、MDA-MB-231+ISO+OE-Nrf2组（转染OE-Nrf2后用100 μmol/L ISO处理）。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测MDA-MB-231细胞增殖;流式细胞术检测MDA-MB-231细胞周期和凋亡;Transwell实验检测MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力;Western blot检测Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白及凋亡蛋白表达。结果：与MDA-MB-231组相比,MDA-MB-231+ISO组、MDA-MB-231+ISO+OE-NC组细胞活力、S期和G2期细胞比例、迁移和侵袭能力、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Nrf2、HO-1、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白水平显著下降（P<0.05）,细胞凋亡率、G1/G0期细胞比例以及Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著上升（P<0.05）。与MDA-MB-231+ISO组相比,MDA-MB-231+ISO+OE-Nrf2组细胞活力、S期和G2期细胞比例、迁移和侵袭能力、Bcl-2、Nrf2、HO-1、MMP-9蛋白水平显著上升（P<0.05）,细胞凋亡率、G1/G0期细胞比例以及Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著降低（P<0.05）。结论：ISO可能通过抑制Nrf2/HO-1信号通路,抑制MDA-MB-231细胞恶性增殖、迁移和侵袭等行为。     

Rac1促进异质型细胞叠套结构的形成

异质型细胞叠套结构（heterotypic cell-in-cell structure，heCICs）与肿瘤发生和发展密切相关，在生命科学研究中的重要性逐渐显露。Ras相关C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）属于经典的Rho GTP酶，在细胞骨架以及细胞运动中起到关键调控作用。为研究Rac1在heCICs形成中的作用和机制，利用活细胞示踪剂cell-tracker分别标记肿瘤细胞和免疫杀伤细胞，建立heCICs模型。利用Rac1抑制剂NSC23766抑制Rac1活性后发现，肿瘤细胞与免疫杀伤细胞之间的heCICs形成率显著降低。通过分子克隆技术获得重组质粒pQCXIP-Rac1-EGFP，进行病毒包装感染肿瘤细胞获得Rac1过表达细胞系。进一步检测Rac1过表达对heCICs形成能力的影响，结果表明，Rac1表达水平升高后，heCICs形成率显著升高。本研究显示Rac1具有促进heCICs形成的作用，这为Rac1作为细胞叠套相关疾病的药物治疗靶点奠定了研究基础。     

DHA联合5-FU通过Rho/ROCK调控胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡的体外实验

该文研究了二十二碳六烯酸(doeosahexaenoic acid,DHA)联合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡及其Rho家族基因表达的影响。实验分为对照组、DHA组、5-FU组和DHA联合5-FU组,用CCK-8法分别检测药物作用24、48、72 h后对人胃癌细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Real-time PCR和Western blot分别检测细胞RhoA、RhoC和ROCK1的mRNA水平和蛋白质水平。结果显示,5-FU单独作用时,随着作用时间延长和剂量加大,对胃癌细胞的增殖抑制作用增强,DHA单独作用时,低浓度抑制作用不明显,较高浓度时有显著抑制作用,40μg/mL DHA与4μg/mL 5-FU联合时有明显的增效作用。与对照组相比,40μg/mL DHA对细胞凋亡作用不明显,60μg/mL DHA主要引起细胞晚期凋亡,16μg/mL 5-FU主要引起细胞早期凋亡,两者联合时对细胞晚期凋亡有显著的增强作用。与对照组相比,DHA组及5-FU组RhoAmRNA水平下降,5-FU及联合组RhoC mRNA水平升高。与对照组相比,DHA组RhoA、RhoC蛋白质水平下降,5-FU组RhoA、ROCK1蛋白质水平下降,而联合组RhoA蛋白质水平下降显著。综上所述,DHA联合5-FU可增强对胃癌SGC7901细胞增殖的抑制作用,两者作用于细胞凋亡的不同时期且联合用药对晚期凋亡有增强作用。DHA与5-FU联合应用对细胞增殖和凋亡作用机制可能通过抑制RhoA蛋白表达起作用。     

MicroRNA-221/222对乳腺癌MDA-MB-231/DOX细胞阿霉素耐药性的影响

目的:探讨微小RNA-221/222(miR-221/222)对乳腺癌MDA-MB-231/阿霉素(DOX)细胞DOX耐药性的影响。方法:采用脂质体法转染miR-221/222抑制物(miR-221/222 inhibitor)至MDA-MB-231/DOX细胞内(Inhibitor组),同时设立空白对照组和转染无关序列的阴性对照组,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测MDA-MB-231细胞株及MDA-MB-231/DOX细胞株的miR-221/222表达水平及转染效率;CCK-8法检测转染48 h后MDA-MB-231/DOX细胞对DOX药物敏感性的变化;流式细胞术(FCM)检测转染MDA-MB-231/DOX细胞的细胞凋亡率;蛋白免疫印迹实验(WB)检测转染后MDA-MB-231/DOX细胞内促凋亡蛋白p53上调凋亡调控因子(PUMA),Bcl2蛋白修饰因子(BMF)以及细胞周期蛋白激酶抑制因子p27(p27Kip1)的表达情况。结果:MDA-MB-231/DOX细胞中的miR-221/222表达水平高于亲本MDA-MB-231细胞(P0.05);MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 96 h后,miR-221/222的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);与空白对照组相比,MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 48h后,DOX继续处理48 h后,细胞的凋亡率明显升高,且细胞内的促凋亡蛋白PUMA,BMF以及p27Kip1的表达均增加(P0.05);DOX对inhibitor组耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)显著低于空白对照组细胞及阴性对照组(P0.05)。结论:miR-221/222能够增加MDA-MB-231/DOX细胞对DOX的耐药性,这可能与下调促凋亡蛋白的表达有关;降低miR-221/222水平可诱导MDA-MB-231/DOX凋亡,并且上调促凋亡蛋白的表达,从而部分逆转MDA-MB-231/DOX对DOX的耐药性。     

黄芩素调节Rho-ROCK-MLC通路抑制乳腺癌细胞的生长与转移

本文探讨黄芩素对人乳腺癌细胞MDA-MB-231异种移植瘤裸鼠的肿瘤生长和肺转移的抑制作用及机制。将20只雌性BALB/c裸鼠随机分为正常组、模型组、紫杉醇组及黄芩素组,每组5只,建立人乳腺癌异种移植瘤裸鼠模型,黄芩素组以50 mg/kg黄芩素腹腔注射(qod),紫杉醇组注射10 mg/kg紫杉醇(biw),正常组和模型组以生理盐水腹腔注射(qd)8周。实验结果显示,紫杉醇组及黄芩素组瘤重、肺转移结节数和转移灶小于模型组。黄芩素和ROCK抑制剂Y-27632单用及联用均能抑制MDA-MB-231细胞的迁移力和细胞骨架蛋白表达,同时抑制ROCK1、Rac1、RhoA和p-MLC蛋白水平。     

二氢杨梅素抑制人乳腺癌细胞侵袭和下调MMP-2/-9蛋白表达研究

藤茶活性成分二氢杨梅素(3, 5, 7, 3′, 4′, 5′-六羟基-2, 3-二氢黄酮醇,DMY)体外对几种癌细胞具有抗增殖作用,但机制尚未完全清楚．本文研究DMY对人高转移型乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的影响,并探讨可能的机制．用MTT法检测DMY对MDA-MB-231细胞的增殖抑制率;明胶酶谱分析明胶酶活力;基质金属蛋白酶(MMP-2/-9)的基因表达水平和蛋白质表达水平分别利用实时定量PCR和Western blot分析进行检测．Transwell模型检测DMY对肿瘤细胞侵袭的影响．结果显示,DMY以剂量依赖方式抑制MDA-MB-231细胞的增殖,作用48 h的IC50为73.6 mg/L．DMY显著抑制明胶酶活性和MMP-2/-9蛋白表达,并抑制MMP-2/-9 的mRNA表达水平．此外,DMY不依赖细胞毒作用和以剂量依赖方式抑制MDA- MB-231细胞的侵袭．这些结果提示：DMY能显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭和增殖, 其侵袭抑制的机制可能与其下调MMP-2/-9蛋白表达水平相关．     

转化生长因子β1影响三阴性乳腺癌顺铂耐药的机制研究

摘要 目的：建立三阴性乳腺癌MDA-MB-231/顺铂（DDP）耐药细胞株,探讨转化生长因子β1（TGF-β1）调控三阴性乳腺癌DDP耐药的机制。方法：采用小剂量间歇诱导法建立MDA-MB-231耐药细胞株（MDA-MB-231/DDP）,在MDA-MB-231/DDP中构建TGF-β1沉默细胞并分为TGF-β1沉默组（sh-TGF-β1）、阴性对照组以及对照组,实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测TGF-β1含量。另取MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/DDP细胞分为MDA-MB-231组（正常培养MDA-MB-231敏感细胞）、MDA-MB-231-DDP组（正常培养MDA-MB-231 DDP耐药细胞）、TGFβ1-shRNA组（MDA-MB-231 DDP细胞转染TGFβ1-shRNA慢病毒载体）和MDA-MB-231-DDP+3-MA组（MDA-MB-231 DDP细胞给予5mM 3-MA处理2 h）。细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测耐药株的半数抑制浓度（IC₅₀）,并计算耐药指数及逆转耐药指数,RT-qPCR检测TGF-β1含量,蛋白印迹法（Western blot）检测TGF-β1、自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II表达量,激光共聚焦显微镜观察自噬流的变化,应用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果：成功建立DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP,耐药指数为5.231;MDA-MB-231/DDP细胞的TGF-β1 mRNA表达和蛋白表达较MDA-MB-231细胞显著上调（P<0.05）。DDP耐药细胞MDA-MB-231/DDP中自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达较MDA-MB-231细胞显著升高（P<0.05);应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）后MDA-MB-231/DDP细胞自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达显著下降（P<0.05);沉默MDA-MB-231/DDP细胞的TGF-β1基因后,DDP耐药细胞株的耐药指数从5.231下降到3.404,同时自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达降低（P<0.05）,且激光共聚焦显微镜观察到黄色和红色斑点的显著减少,表明自噬受到抑制。结论：TGF-β1与三阴性乳腺癌DDP耐药有关,其机制可能是增加自噬引起MDA-MB-231细胞DDP耐药。通过沉默TGF-β1可降低自噬水平,恢复三阴性乳腺癌细胞对DDP的敏感性。     

山柰酚通过线粒体凋亡通路诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的机制研究

本文旨在探讨山柰酚对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用及其可能的分子机制。用不同浓度的山柰酚处理细胞,CCK-8法检测山柰酚对MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A活力的影响,倒置显微镜观察各组细胞形态变化,克隆形成法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的改变,Western blot检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt C)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表达,比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)的活性。结果显示,山柰酚体外可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖,诱导细胞凋亡,且对正常乳腺上皮细胞活力无影响,降低细胞线粒体膜电位,上调Bax、Cyt C的表达,下降Bcl-2和Cyclin D1的表达,增强Caspase-3、Caspase-9活性。结果表明,线粒体凋亡信号通路的激活是山柰酚诱导MDA-MB-231细胞凋亡的途径之一。     

"拉链(zipper)"与"触发(trigger)"--细菌侵袭的分子机制

对宿主细胞的侵袭是细胞内菌致病的关键步骤。细菌侵袭过程与Rho、Rac和Cdc42等Rho家族成员介导的肌动蛋白细胞骨架重排有关,涉及“拉链(zipper)”与“触发(trigger)”两种主要机制以及“拉链-触发(zipper-trigger)”双重机制。研究细菌侵袭过程中Rho家族的作用及相应细胞骨架事件,有助于揭示细菌侵袭的分子机制。     

单磷酸腺苷酸化修饰:一种蛋白质翻译后修饰方式

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能够通过Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion systems,T3SSs)分泌效应蛋白Vop S,催化三磷酸腺苷(ATP)分子中的单磷酸腺苷(AMP)通过磷酸二酯键共价连接至宿主细胞Rho鸟苷三磷酸激酶(Rho GTPases)成员蛋白Rho A、Rac1和Cdc42的特定的苏氨酸残基上,导致宿主细胞肌动蛋白骨架崩解,细胞变圆。该发现推动了一种蛋白质翻译后修饰方式——单磷酸腺苷酸化(AMPylation)修饰的迅速发展,其中催化AMPylation修饰的蛋白质称为单磷酸腺苷酸化酶(AMPylator)。目前的研究表明,与蛋白质的磷酸化修饰类似,蛋白质AMPylation在真核以及原核生物中都是一种重要的调控蛋白质功能的翻译后共价修饰调节机制。与AMPylation相对应的是去单磷酸腺苷酸化(de-AMPylation),即去单磷酸腺苷酸化酶(de-AMPylase)催化修饰后的蛋白质脱去AMP基团的过程,使底物蛋白重新恢复其原有的生物学功能。现就蛋白质AMPylation修饰的催化过程、AMPylation修饰的研究进展以及AMPylator/de-AMPylase的种类、物种来源、结构、功能和底物等方面的内容进行综合阐述。此外,就目前已有的AMPylation检测方法进行了总结,其中详细阐述了一种化学标记法的原理和过程。