脓肿分枝杆菌MBT结构鉴定与比较演化分析

【背景】作为临床最常见的非结核条件致病分枝杆菌,脓肿分枝杆菌(Mycobacteroides abscessus)因其天然、多耐药等特性成为目前临床治疗的一大挑战。作为分枝杆菌限制性营养元素——铁摄取的关键系统,分枝杆菌素(mycobactin,MBT)、羧基分枝杆菌素(carboxymycobactin,cMBT)与病原分枝杆菌的毒力、耐药等密切相关。【目的】丰富分枝杆菌MBT、cMBT结构数据,探究MBT在致病分枝杆菌起源过程中的演化规律。【方法】在MALDI-TOF-MS与FT-MS/MS解析脓肿MBT、cMBT结构的基础上,进一步开展其活性分析与生物合成基因簇比较基因组分析。【结果】虽然脓肿分枝杆菌MBT、cMBT母核修饰模式与海洋分枝杆菌最相似,R1、R2、R3、R5等位置的修饰完全相同,而且脂肪酸链均位于R4位置;但脂肪酸链长度不同[C10-17 (MBT)、C4-8 (cMBT)],为新结构。Fe-cMBT不仅以浓度依赖方式促进脓肿分枝杆菌生长,而且利用效率显著高于FeCl₃,相关结果表明MBT-cMBT是脓肿分枝杆菌高效获取铁元素的关键系统。与MBT结构结果一致,mbt-1基因簇共线性分析及mbt-1、mbt-2系统发育分析结果均表明脓肿分枝杆菌与海洋分枝杆菌(M.marinum)亲缘关系最近,而非结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或耻垢分枝杆菌(M.smegmatis) (基于16S rRNA基因序列分析)。进一步分析发现,M.marinum、M.tuberculosis、M.bovis等病原分枝杆菌脂肪酸链长度变化范围仅4 C,而M.abscessus、M.fortuitum、M.avium和M.smegmatis等条件致病与非致病菌的脂肪酸链长度变化范围为7-11 C,暗示MBT同系物脂肪酸链长度变化范围与分枝杆菌不同生活方式、环境之间可能存在关联。【结论】作为获取铁元素的关键系统,具有独特结构的脓肿分枝杆菌MBT-cMBT在致病、耐药等方面的作用及起源、演化规律值得深入研究。     

ω-3多不饱和脂肪酸抗肿瘤新途径——抑制具核梭杆菌黏附宿主细胞

【背景】大量文献报道ω-3多不饱和脂肪酸尤其是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)与二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)具有抗肿瘤作用,但是其抗肿瘤机制还不够完善。【目的】探究ω-3多不饱和脂肪酸、具核梭杆菌以及结直肠癌三者之间的关联。【方法】在检测二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸(α-Linolenic Acid,ALA)等ω-3多不饱和脂肪酸对人结直肠腺癌细胞Caco-2、正常结肠上皮细胞NCM460生长影响的基础上,检测DHA等3种多不饱和脂肪酸对具核梭杆菌黏附人体细胞以及Fap2、FadA、RadD等具核梭杆菌毒力关键基因表达的影响。【结果】30μg/mL的DHA、EPA、ALA对Caco-2生长抑制分别为9.09%、4.95%、7.52%,而对NCM460生长抑制达31.15%、25.48%、29.11%,而且相关抑制作用仅具有浓度依赖性而无时间依赖性。经30μg/mL的DHA、EPA、ALA预处理的具核梭杆菌黏附Caco-2细胞的能力分别下降81.04%(P=0)、93.63%(P=0)和68.63%(P=0);而共培养时加入DHA、EPA、ALA对具核梭杆菌黏附Caco-2细胞的能力没有显著影响。同时,30μg/mLDHA处理导致F.nucleatum的Fap2基因显著下降10.22%(P=0.027);30μg/mL EPA处理导致FadA、Fap2基因分别显著下降23.49%(P=0)、15.09%(P=0.003);30μg/mL ALA处理导致FadA基因显著下降26.75%(P=0.012)。【结论】综合上述实验结果以及DHA、EPA、ALA仅能短时间抑制具核梭杆菌生长等文献报道,我们认为,DHA、EPA等ω-3多不饱和脂肪酸并非简单地直接杀伤或抑制肿瘤细胞和F.nucleatum;抑制FadA、Fap2等黏附相关基因表达,降低F.nucleatum黏附宿主细胞能力是其抗肿瘤作用的关键组成部分。ω-3多不饱和脂肪酸等活性物质对F.nucleatum等在结直肠肿瘤发生、发展中发挥重要作用的肠道细菌的影响与机制应深入开展研究。     

具核梭杆菌脂多糖诱导THP-1细胞M2极化及对低浓度白介素6产生的作用

[背景] 在结直肠肿瘤等多种肿瘤中普遍存在的具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）与结直肠肿瘤发生、预后不良、复发及化疗耐药等密切相关。其引发炎症、对肿瘤微环境中巨噬细胞等免疫细胞作用与机制尚待阐明。[目的] 对比分析F.nucleatum脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）与嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）、大肠杆菌（Escherichia coli）的LPS诱导单核细胞极化、炎性细胞因子表达等活性差异,探讨F.nucleatum在诱发慢性炎症、致癌等过程中的作用与机制。[方法] 分别用A.muciniphila、E.coli、F.nucleatum LPS或联合干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ）处理后,观察THP-1、THP-1 M0细胞的细胞形态变化,然后检测M0（CD11B）、M1（CD40、CD86）和M2（CD163、CD206）巨噬细胞标志基因、TLR3、TLR4、IL-6、IL-10等基因转录水平,以及IL-6、IL-10、C反应蛋白（C Reactive Protein,CRP）翻译水平的表达变化。[结果] 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE）分析显示,A.muciniphila、E.coli、F.nucleatum这3种细菌的LPS条带位置、数量存在明显差异。F.nucleatum LPS在具有较强诱导THP-1细胞贴壁的同时,对经佛波肉豆蔻醋酸（Phorbol Myristate Acetate,PMA）处理贴壁的THP-1细胞,无论是单独或是联合IFN-γ处理,诱导形成伪足数、伪足长度及形成梭形细胞比例（M1型巨噬细胞）等均低于A.muciniphila和E.coli LPS。进一步转录水平检测巨噬细胞标志基因表达发现,M1标志基因中,CD40分别上调5 011.0%（P<0.001）、6 048.9%（P<0.001）和1 011.6%（P=0.009 4）,CD86分别上调637.3%（P<0.001）、657.9%（P<0.001）和194.1%（P>0.05）;M2标志基因中,CD163分别下调39.5%（P=0.001 1）、53.7%（P<0.001）和5.9%（P>0.05）,CD206下调18.6%（P>0.05）、88.4%（P=0.005 5）和24.8%（P>0.05）。TLR、白介素家族基因转录水平分析发现,TLR3分别下调32.3%（P=0.044 7）、311.5%（P=0.001 9）、9.6%（P>0.05）;IL-6分别上调17 763.2%（P<0.001）、35 458.2%（P<0.001）、1 123.6%（P>0.05）;IL-10分别上调729.3%（P<0.001）、1 223.3%（P<0.001）、124.4%（P>0.05）。翻译水平上,A.muciniphila、E.coli、F.nucleatum LPS单独或联合IFN-γ处理时,THP-1细胞产生IL-6分别为0.16、6.17、0 pg/mL与410.03、1 334.40、46.20 pg/mL。[结论] F.nucleatum LPS不仅具有较强招募单核细胞并诱导其向M2极化的作用,同时,具有诱导巨噬细胞分泌低浓度IL-6的特性,说明其在引发慢性炎症及肿瘤免疫应答、逃逸等过程中发挥重要作用。综合上述信息,对致癌、免疫激活及肿瘤治疗相关细菌LPS的结构、活性、分子机制等研究将有助于明确革兰氏阴性细菌在慢性炎症、肿瘤发生、免疫调控等中的作用,以期为相关疾病预防与治疗提供新的策略与靶点。