人生长激素基因导入金鱼受精卵内的整合、表达和促生长效应研究

通过显微注射法把小鼠ＭＴ启动子与人生长激素的融合基因（ＭＴ－ｈＧＨ）导入红龙睛金鱼受精卵内,共注射１５０６个卵子,获得８００多尾成鱼。经斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交表明,导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因与部分受体鱼的染色体ＤＮＡ发生了整合,整合率为２２％,转基因鱼血清中的生长激素含量平均高于对照组,平均生长速度高于对照组。导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因可以遗传给后代。     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱．把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究．采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物．对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都高于对照组．     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱。把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究。采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物。对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都     

Studies on Pattern of Producing Transgenic Fish I.Production and Detection of All fish TRansgenic Common Carp With cMT sGH Gene

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一项重要研究就是利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件;二是外源基因的高整和率与高表达。已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射,将鲤鱼金属硫蛋白启动子（ｃＭＴ）与大马哈鱼生长激素基因（ｓＧＨ）的融合基因（ｃＭＴｓＧＨ）导入鲤鱼单细胞后期的早期胚胎,构建了全鱼转基因鲤鱼。通过斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结合ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,对外源ｓＧＨ的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼,收集卵子和精子,湿法受精获得受精卵。经过基因注射,孵化后的鱼苗放入水族箱。待鱼苗平游,提取总ＤＮＡ进行检测。以ＰｓｔＩ酶切质粒ｐｃＭＴｃＧＨ（Ｆｉｇ．４）分离３．４ＫｂｓＧＨ片段,用随机引物标记,作为杂交探针。同时,设计并合成ｓＧＨ基因的ＰＣＲ特异引物。Ｆｉｇ．１的斑点杂交结果与Ｆｉｇ．２的ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ结果相比较（Ｔａｂｌｅ１）,说明斑点杂交存在着高的假阳性。而ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ将ＰＣＲ的快速、方便与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ的准确性相结合,排除了Ｐ     

野生型及启动子区突变的HPFHAγ基因在MEL细胞中的表达

研究了野生型Ａγ珠蛋白基因、中国型胎儿血红蛋白持续存在综合症（ＨＰＦＨ）Ａγ基因（启动子区－１９６Ｃ－Ｔ突变）及希腊型ＨＰＦＨＡγ基因（－１１７Ｇ－Ａ突变）在鼠红白血病（ＭＥＬ）ＧＭ９７９细胞中的表达,比较每个整合的Ａγ基因明显增加的表达水平,而－１１７Ｇ－Ａ１９６Ｃ－Ｔ突变Ａγ基因未显示比野生型Ａγ基因明显增加的表达水平,而－１１７Ｇ－Ａ空变Ａγ基因在未分化的及ＨＭＢＡ或丁酸钠诱导分化的ＭＥＬＧ     

大鼠卵巢绒毛膜促性腺激素受体在CHO中的表达和扩增

本文报道了利用二氢叶酸还原酶放大系统将大鼠ＬＨ／ｈＣＧ受体（记为Ｆ－ｈＣＧＲ）及其胞外肽段（记为Ｔ－ｈＣＧＲ）在中国苍鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中的表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,Ｆ－ｈＣＧＲ为一条蛋白质带,其表观分子量为９２ｋｄ,而Ｔ－ｈＣＧＲ为３５ｋｄ和３７ｋｄ两条带。表达受体对其配基ｈＣＧ表现出高的亲合力,Ｆ－ｈＣＧＲ的解离常数为７×１０－９ｍｏｌ／Ｌ,Ｔ－ｈＣＧＲ为６．４×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞可结合１２５Ｉ－ｈＣＧ,而表达Ｔ－ｈＣＧＢ者不结合１２５Ｉ－ｈＣＧ。这提示Ｆ－ｈＣＧＲ主要存在于细胞质膜表面上。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞能刺激。ｃＡＭＰ的形成,而表达Ｔ－ｈＣＧＲ者不能刺激ｃＡＭＰ形成。免疫荧光定位结果表明,Ｔ－ｈＣＧＲ主要分布于质膜的细胞质侧以及胞内其他一些细胞器膜上。用免疫亲和层析可以得到纯化的Ｔ－ｈＣＧＲ。     

人绒毛膜促性腺激素β—亚基在中国仓鼠卵巢细胞中…

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ为运载体,构建了受控于ＳＶ４０早期启动子β－ｈＣＧ基因的表达载体,转染ＣＨＯ－ｈｆｒ＾－细胞后,挑选ＣＨＯ（ｄｈｆｒ＾＋）细胞,结果表明β－ｈＣＧ不仅在细胞中表达,不分泌到培养液中,通过氨甲喋（ＭＴＸ）加压后,表达量逐渐提高,０．１μｍｏｌ／ＬＭＴＸ条件下培养液中β－ｈＣＧ最高表达量可达到１．５μｇ／１０＾６细胞．２４小时。经亲和层析获得纯的重组β－ｈＣ     

人绒毛膜促性腺激素β－亚基在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ为运载体，构建了受控于ＳＶ４０早期启动子β－ｈＣＧ基因的表达载体，转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞后，挑选ＣＨＯ（ｄｈｆｒ－）细胞，结果表明β－ｈＣＧ不仅在细胞中表达，还分泌到培养液中。通过氨甲喋呤（ＭＴＸ）加压后，表达量逐渐提高，０．１μｍｏｌ／ＬＭＴＸ条件下培养液中β－ｈＣＧ最高表达量可达到１．５μｇ／１０６细胞·２４小时。经亲和层析获得纯的重组β－ｈＣＧ，其分子量与天然制品一致，放射免疫测定的免疫原性为天然制品的８４．９％。     

鱼类精子携带源基因导入

将鲤鱼（或泥鳅）精子在保存液内与人生长激素（ｈＧＨ）重组质粒ＤＮＡ保温,再与鲤（或泥鳅）卵受精。由此发育的鱼苗经ＤＮＡ分子杂交和ＰＣＲ检测证明,３３．３％（或３７．０％）的个体带ｈＧＨ基因,其拷贝数在４－１５０／细胞之间。在一定条件下,精子可作为携带外源基因的载体,通过受精作用产生转基因鱼。     

人基因使猪减少脂肪

美国农业部（ＵＳＤＡ）（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｅ,ＭＤ）的研究者采用ＧｅｎｅｍｅｄｉｃｉｎｅＩｎｃ．’ｓ（ＴｈｅＷｏｏｄｌａｎｄｓ,ＴＺ）公司的胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ－１）基因培育出体脂减少的猪。此项研究将ＩＧＦ－１转基因猪与导入生长激素（ＧＨ）基...     

用~1H NMR和FT－IR研究hF－GRP及其类似物TF14与DMPC脂质体的相互作用

用１ＨＮＭＲ和ＦＴ－ＩＲ技术研究了肽激素ｈＦ－ＧＲＰ及其类似物ＴＦ１４与ＤＭＰＣ脂质体的相互作用及其构象变化,１Ｈ－ＮＭＲ实验结果提示这两个肽与ＤＭＰＣ之间存在静电相互作用,这使其可从水相结合到脂相中。ＦＴ－ＩＲ实验结果显示它们的构象从水相到脂相确实发生了某些调整变化,ｈＦ－ＧＲＰ趋于更加固定和弯曲,ＴＦ１４趋于更加伸展。以上工作为进一步从事ｈＦ－ＧＲＰ和ＴＦ１４受体结合的研究奠定了基础。     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是鱼类定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹蹲鱼生长激素ｃＤＮＡ上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快２０％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（Ｆｉｇ．１,插入片段为０．８Ｋｂ,位于ＸｂａＩ和ＰｓｔＩ之间）的表达质粒（Ｆｉｇ．２,命名为ｐＣＭＶ－ＴＫ－ＣＧＨ）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,共注射了１０００粒卵,获得了转基因实验鲫鱼４８０尾,孵化率为４８％。将其中１００尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的５０尾进行ＰＣＲ（检测。其中８条鱼的基因组ＤＮＡ有０．６Ｋｂ的ＰＣＲ扩增产物（Ｆｉｇ．３）,表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为１６％。其中最大的一条体重４．２ｇ,体长６ｃｍ,比对照（０．７ｇ,４ｃｍ）体重增加５倍,体长增加２ｃｍ（Ｆｉｇ．４）。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和     

重组人MCAF／GM－CSF融合蛋白表达及其生物学活性研究

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法,把作为导向效应细胞到靶部位的单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）进行基因融合,置于ｐＢＶ２２０载体的λＰＲＰＬ串联启动子下游,构建了ＳＤ序列与ＡＴＧ之间含有不同核苷酸组成的重组质粒ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３。ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３的翻译起始区都不存在稳定的二级结构,但ＤＨ５α（ｐＭＧ０２、ＤＨ５α（ｐＭＧ０３）的表达水平远远高于ＤＨ５α（ｐＭＧ０１）,ＤＨ５α（ＰＭＧ０１）几乎没有表达。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,它能分别与ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ抗体发生特异反应。生物学活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性和维持ｈＧＭ－ＣＳＦ依赖的ＴＦ１细胞生长的特性,说明ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ的生物学功能是相容的．     

重组人生长激素在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达研究

对重组人生长激素基因工程菌ｐＥＴ－１１ｂ／ｒｈＧＨ／ＢＬ２１的培养条件进行了优化,在ＮＢＳ ＭＰＰ－４０发酵罐中实现了高密度培养和高效表达,三批实验结果表明,在较短的发酵时间（１２ｈ）内细菌干重达８５ｇ／Ｌ,重组人生长激素占总蛋白量的２５％左右。     

131Ⅰ－McAbJH_（107）在载人肝癌BEL－7402裸鼠体内的放射免疫显像分析

用氯胺Ｔ碘标技术标记抗人肝癌单克隆抗体ＪＨ１０７（ＭｃＡｂＪＨ１０７）,观测其在载人肝癌ＢＥＬ７４０２裸鼠模型上的分布显像情况,氯胺Ｔ碘标法标记率５０％。每鼠腹腔注射２００Ｃｉ１３１Ⅰ－ＭｃＡｂＪＨ１０７,放射性物质第２４ｈ开始在肿瘤部位浓聚、逐步加强,９６ｈ达高峰,肿瘤组织较清楚显像并维持至１４８ｈ;同时周围组织放射性本底逐步减弱、消失。对照组１３１Ⅰ－ＮＩｇＧ呈全身均匀分布。无明显放射性物质浓聚及清楚显像。在４８ｈ和９６ｈ,１３１Ⅰ－ＭｃＡｂＪＨ１０７在１２种正常组织（脑除外）的Ｔ／ＮＴ均值分别为３．３８和６．２６,而１３１Ⅰ－ＮＩｇＧ的Ｔ／ＮＴ均值均低于１．０。     

转OMT／PGH基因猪外源基因整合及遗传特性研究

实验以转ＯＭＴ／ＰＧＨ基因猪的Ｇ０,Ｇ１,Ｇ２和Ｇ３代共８头猪为材料,应用同位素和非同位素标记的染色体原位杂交技术,对外源ＯＭＴ／ＰＧＨ基因在猪染色体上整合位点进行研究,结果表明：（１）外源基因可以整合在染色体上,整合的位点是随机的。（２）整合在染色体上的外源基因可以遗传给子代;（３）整合在染色体上的外源基因在转基因动物世代过程中整合的位点是相对稳定的。     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣ ＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＧＤＦ）、ＰＧＤＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）基因表达和肾素－血管紧张系统（ＲＡＳ）的影响,结果显示,ＨＳＰＧ明显抑制培养的ｈＡＳＭＣ基础的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：１０３８５±３２６３ｖｓ,２５５４１±６４２１,Ｐ＜０．０１）及外源性ＰＤＧＦ诱导的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：９８７８±１９４７ｖｓ．１３４８１±４４ｌ０,Ｐ＜０．０５）;抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－Ｂｐ和ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,提高ＰＤＧＦａ和β受体ｍＲＮＡ的表达;显著降低ｈＡＳＭＣ培养液中血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）的浓度和血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）的活性,推测ＨＳＰＧ抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－β及ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,降低ＡＣＥ活性及ＡｎｇⅡ浓度是其抑制ｈＡＳＭＣ增殖的重要机     

金属硫蛋白 - 潜伏膜蛋白融合基因的体外转录调控

ＥＢ病毒（ＥＢＶ）是一种与地区性伯基特氏淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金氏病等多种人体肿瘤有关的疱疹病毒．已往的研究表明,潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）基因是ＥＢＶ最可能的致瘤基因．为制备ＬＭＰ基因转基因小鼠,探讨ＬＭＰ的体内致瘤作用,首先构建了含鼠金属硫蛋白－１（ＭＴ－１）基因调控区和ＬＭＰ基因编码区的ｐＢＲ３２２－ＭＴ－ＬＭＰ质粒,并用电击法将该质粒与ｐＫＪ１－Ｎｅｏ质粒共转染人胃癌细胞株ＭＧＣ,对ＭＴ－ＬＭＰ基因在转染细胞中的整合、转录情况及重金属镉和镍对该融合基因的转录调控进行了研究．结果表明：（１）两质粒共转染效率为８６．７％;（２）ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析显示,完整的ＭＴ－ＬＭＰ基因已整合入转染的ＭＧＣ细胞基因组,且在不同的转染细胞克隆中,ＭＴ－ＬＭＰ基因整合的方式及拷贝数不同,拷贝数从１到１９不等;（３）ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析证实,ＭＴ－ＬＭＰ基因不仅在转染的ＭＧＣ中能够转录,而且在１０μｍｏｌ／Ｌ镉诱导下,ＭＴ－ＬＭＰ基因转录增强,平均增高约１．４倍．结果说明,在ＭＴ－１基因调控区指导下,ＬＭＰ基因不但有ｍＲＮＡ水平的表达,而且其表达受重金属镉的调控,上述结果为制备ＭＴ－ＬＭＰ转基因小鼠